O método de dissolução apropriado é um fator importante para o sucesso de experimentos com peptídeos. A dissolução inadequada causará a perda de peptídeos e o fracasso do experimento. No entanto, encontrar o método de dissolução ideal às vezes é bastante desafiador. A seguir estão os métodos de dissolução propostos pelos dois grupos técnicos da MOL Changes. método
Guia de dissolução do grupo de tecnologia MOL Changes
O principal problema na dissolução de peptídeos é a formação de estrutura secundária.
Embora a formação de estruturas secundárias de cadeias peptídicas hidrofóbicas seja mais óbvia, exceto para as cadeias peptídicas mais curtas, este fenômeno ocorre em quase todas as cadeias peptídicas, independentemente da polaridade. Portanto, o primeiro princípio de dissolução de polipeptídeos é usar água destilada estéril ou água deionizada (ou água sem oxigênio, se as condições permitirem).
A solução peptídica pode encontrar degradação bacteriana. Para evitar esse fenômeno, o peptídeo deve ser dissolvido em água destilada estéril, ou filtrado com uma membrana filtrante com tamanho de poro de 0.45 ou 0.2 μm para esterilização. Polipeptídeos contendo Cys, Conheci, e Trp são particularmente suscetíveis à oxidação, então eles devem ser dissolvidos em água sem oxigênio. Água isenta de oxigênio pode ser obtida por desgaseificação sob pressão reduzida por injeção de gases inertes (azoto, hélio, e argônio).
Se o peptídeo for insolúvel em água pura, o tratamento ultrassônico pode ajudar a quebrar as partículas e aumentar a solubilidade. Observação: O tratamento ultrassônico causará aquecimento da solução e degradação do peptídeo.
Se o peptídeo contém vários aminoácidos básicos, use solução aquosa de ácido acético de 1 a 10%; para peptídeos muito hidrofóbicos, usar 50% ácido acético.
Se o polipeptídeo contiver uma grande quantidade de aminoácidos ácidos, pode ser dissolvido em um 1 para 10% solução de amônia ou um tampão alcalino volátil, como acetato de etilmorfina ou bicarbonato. O valor do pH deve ser ajustado antes da cromatografia.
Se o peptídeo for carregado na coluna, a quantidade de solvente orgânico deve ser muito pequena, caso contrário, o tempo de retenção será seriamente afetado.
Se o polipeptídeo for altamente hidrofóbico porque contém cadeias laterais de hidrocarbonetos aromáticos, como Val, Leu, Conheci, Phe, Tyr, Alá, etc., ou é um peptídeo neutro, o uso de desnaturantes de membrana como DMF ou DMSO pode ajudar a dissolver o polipeptídeo:
um. Desnaturantes de membrana de alta concentração ajudam a dissolver o polipeptídeo, destruindo sua estrutura secundária.
b. Desnaturantes de membrana são adequados para a preparação de soluções de análise de peptídeos, mas pode interferir na pesquisa sobre sua atividade biológica.
c. DMF é o melhor desnaturante (a maior concentração pode atingir 30%), e é adicionado gota a gota até que o peptídeo seja dissolvido.
d. Durante a cromatografia de fase reversa, O DMF fluirá junto com o pico frontal do eluente. Dependendo do volume de injeção, o valor de pico pode ser muito alto. A maioria dos peptídeos pode eluir dentro de alguns minutos após a eluição de uma grande quantidade de DMF. Se a cadeia peptídica for pequena e eluir muito cedo, a quantidade do peptídeo será reduzida.
MOL Changes Guia de Dissolução do Grupo Técnico II
Como distinguir se os aminoácidos são neutros, ácido ou alcalino, e calcule o método de dissolução:
1. Atribua cada aminoácido ácido na sequência polipeptídica incluindo ácido aspártico Asp (D), ácido glutâmico Glu (E) e carboxil-COOH C-terminal como -1; cada aminoácido básico, incluindo arginina Arg ( R), lisina Lys (K), histidina Sua (H) e o amino-NH2 N-terminal recebem um valor de +1; aminoácidos neutros são 0. Com base nisso, o valor de todo o polipeptídeo é calculado, e a pontuação é positiva Os peptídeos com pontuação negativa são chamados de peptídeos básicos, aqueles com pontuação negativa são chamados de peptídeos ácidos, e aqueles com pontuação zero são chamados de peptídeos neutros.
2. Se for um peptídeo alcalino, tente dissolvê-lo com água primeiro; se não puder ser dissolvido, tente usar 10% – 30% ácido acético; se o peptídeo ainda for insolúvel, tente usar ácido acético puro e ácido trifluoroacético TFA (<50 μl) para dissolvê-lo, e então diluir a solução peptídica até a concentração desejada.
3. Se for um peptídeo ácido, tente dissolvê-lo com água primeiro; se não puder ser dissolvido com água, tente usar 13% água com amônia (v/v) para dissolvê-lo, e diluir a solução peptídica até a concentração necessária. Se a sequência peptídica contém cisteína Cys (C), não pode ser dissolvido em solução alcalina. Por favor, tente os métodos abaixo.
4. Peptídeos neutros são geralmente dissolvidos em solventes orgânicos. Primeiro, tente usar acetonitrila (acetonitrila), ou metanol (metanol) ou isopropanol (isopropanol) dissolver; para peptídeos muito hidrofóbicos, primeiro dissolva com uma pequena quantidade de dimetilsulfóxido (DMSO) e diluir com água até a concentração necessária; se a sequência peptídica contém cisteína Cys (C), usar dimetilformamida (DMF) ou N-metilpirrolidona (NMP) para dissolução. Para peptídeos propensos à agregação, primeiro adicione guanidina·HCl 6M ou ureia 8M (Uréia) para dissolvê-los, e depois diluí-los até a concentração necessária.
ilustrar:
1. Para facilitar o armazenamento e posterior utilização, recomenda-se dissolver o peptídeo a uma concentração de cerca de 1-2 mg/ml.
2. O pó liofilizado de peptídeo comum pode ser armazenado a -20°C por mais de um ano. Para peptídeos dissolvidos, recomenda-se alíquotar e armazenar a -20°C; se a sequência peptídica contém metionina Met (M), cisteína Ácido Cys (C) ou tirosina Tyr (S) recomenda-se que seja armazenado em um ambiente livre de oxigênio para evitar oxidação.
Lista de aminoácidos em anexo:
1.Aminoácidos neutros: glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, cisteína, metionina, treonina, serina, fenilalanina, tirosina, ácido triptofano, prolina, asparagina e glutamina
Fcomidas: Este tipo de molécula de aminoácido contém apenas um grupo amino e um grupo carboxila
2.Aminoácidos ácidos: ácido glutâmico, ácido aspártico
Características: Este tipo de molécula de aminoácido contém um grupo amino e dois grupos carboxila
3.Aminoácidos básicos: lisina, arginina, histidina
Características: Este tipo de aminoácido contém um grupo diaminocarboxila em sua molécula; a histidina tem um anel de nitrogênio e é fracamente alcalina, e também é um aminoácido básico.
