Die richtige Auflösungsmethode ist ein wichtiger Faktor für den Erfolg von Peptidexperimenten. Eine unsachgemäße Auflösung führt zum Verlust von Peptiden und zum Scheitern des Experiments. Jedoch, Die ideale Auflösungsmethode zu finden, ist manchmal eine große Herausforderung. Im Folgenden sind die von den beiden technischen Gruppen von MOL Changes vorgeschlagenen Auflösungsmethoden aufgeführt. Verfahren
Leitfaden zur Auflösung der Technology Group durch MOL
Das Hauptproblem bei der Peptidauflösung ist die Bildung einer Sekundärstruktur.
Allerdings ist die Bildung von Sekundärstrukturen hydrophober Peptidketten offensichtlicher, mit Ausnahme der kürzesten Peptidketten, Dieses Phänomen tritt in fast allen Peptidketten auf, unabhängig von der Polarität. daher, Das erste Prinzip beim Auflösen von Polypeptiden besteht in der Verwendung von sterilem destilliertem Wasser oder entionisiertem Wasser (oder sauerstofffreies Wasser, wenn die Bedingungen dies zulassen).
Die Peptidlösung kann einem bakteriellen Abbau ausgesetzt sein. Um dieses Phänomen zu vermeiden, Das Peptid sollte in sterilem destilliertem Wasser gelöst werden, oder filtriert mit einer Filtermembran mit einer Porengröße von 0.45 oder 0.2 μm zur Sterilisation. Polypeptide, die Cys enthalten, Getroffen, und Trp sind besonders anfällig für Oxidation, Daher sollten sie in sauerstofffreiem Wasser gelöst werden. Sauerstofffreies Wasser kann durch Entgasung unter vermindertem Druck durch Einblasen von Inertgasen gewonnen werden (Stickstoff, Helium, und Argon).
Wenn das Peptid in reinem Wasser unlöslich ist, Eine Ultraschallbehandlung kann helfen, die Partikel aufzubrechen und die Löslichkeit zu erhöhen. Notiz: Die Ultraschallbehandlung führt zu einer Erwärmung der Lösung und einem Abbau des Peptids.
Wenn das Peptid mehrere basische Aminosäuren enthält, Verwenden Sie eine 1–10 %ige wässrige Essigsäurelösung; für sehr hydrophobe Peptide, verwenden 50% Essigsäure.
Wenn das Polypeptid eine große Menge saurer Aminosäuren enthält, es kann in einem aufgelöst werden 1 Zu 10% Ammoniaklösung oder ein flüchtiger alkalischer Puffer wie Ethylmorphinacetat oder -bicarbonat. Vor der Chromatographie muss der pH-Wert eingestellt werden.
Wenn das Peptid auf die Säule geladen werden soll, die Menge an organischem Lösungsmittel muss sehr gering sein, Andernfalls wird die Aufbewahrungszeit erheblich beeinträchtigt.
Wenn das Polypeptid stark hydrophob ist, weil es aromatische Kohlenwasserstoffseitenketten wie Val enthält, Leu, Getroffen, Phe, Tyr, Ala, usw., oder ist ein neutrales Peptid, Die Verwendung von Membrandenaturierungsmitteln wie DMF oder DMSO kann zur Auflösung des Polypeptids beitragen:
A. Hochkonzentrierte Membrandenaturierungsmittel tragen zur Auflösung des Polypeptids bei, indem sie dessen Sekundärstruktur zerstören.
B. Membrandenaturierungsmittel eignen sich zur Herstellung von Peptidanalyselösungen, können aber die Erforschung ihrer biologischen Aktivität beeinträchtigen.
C. DMF ist das beste Denaturierungsmittel (die höchste Konzentration, die erreicht werden kann 30%), und wird tropfenweise zugegeben, bis das Peptid gelöst ist.
D. Während der Umkehrphasenchromatographie, DMF fließt zusammen mit dem vorderen Peak des Eluenten aus. Abhängig von der Injektionsmenge, Der Spitzenwert kann sehr hoch sein. Die meisten Peptide können innerhalb weniger Minuten eluieren, nachdem eine große Menge DMF eluiert wurde. Wenn die Peptidkette klein ist und zu früh eluiert, die Menge des Peptids wird reduziert.
MOL ändert den technischen Auflösungsleitfaden für Gruppe II
Wie erkennt man, ob Aminosäuren neutral sind?, sauer oder alkalisch, und berechnen Sie die Auflösungsmethode:
1. Ordnen Sie jede saure Aminosäure in der Polypeptidsequenz zu, einschließlich Asparaginsäure Asp (D), Glutaminsäure Glu (E) und C-terminales Carboxyl-COOH als -1; jede basische Aminosäure einschließlich Arginin Arg ( R), Lysin Lys (K), Histidin His (H) und dem N-terminalen Amino-NH2 wird ein Wert von zugewiesen +1; neutrale Aminosäuren sind 0. Basierend darauf, der Wert des gesamten Polypeptids wird berechnet, und der Wert ist positiv. Peptide mit einem negativen Wert werden Basispeptide genannt, diejenigen mit einem negativen Wert werden saure Peptide genannt, und diejenigen mit einem Wert von Null werden neutrale Peptide genannt.
2. Wenn es sich um ein alkalisches Peptid handelt, Versuchen Sie es zunächst mit Wasser aufzulösen; wenn es nicht aufgelöst werden kann, Versuchen Sie es zu verwenden 10% – 30% Essigsäure; wenn das Peptid noch unlöslich ist, Versuchen Sie, reine Essigsäure und Trifluoressigsäure TFA zu verwenden (<50 μl) um es aufzulösen, und dann die Peptidlösung auf die gewünschte Konzentration verdünnen.
3. Wenn es sich um ein saures Peptid handelt, Versuchen Sie es zunächst mit Wasser aufzulösen; wenn es nicht mit Wasser gelöst werden kann, Versuchen Sie es zu verwenden 13% Ammoniakwasser (v/v) um es aufzulösen, und verdünnen Sie die Peptidlösung auf die erforderliche Konzentration. Wenn die Peptidsequenz Cystein Cys enthält (C), es kann nicht in alkalischer Lösung gelöst werden. Bitte probieren Sie die folgenden Methoden aus.
4. Neutrale Peptide werden üblicherweise in organischen Lösungsmitteln gelöst. Erste, Versuchen Sie es mit Acetonitril (Acetonitril), oder Methanol (Methanol) oder Isopropanol (Isopropanol) aufzulösen; für sehr hydrophobe Peptide, Zuerst mit einer kleinen Menge Dimethylsulfoxid auflösen (DMSO) und mit Wasser auf die erforderliche Konzentration verdünnen; wenn die Peptidsequenz Cystein Cys enthält (C), Verwenden Sie Dimethylformamid (DMF) oder N-Methylpyrrolidon (NMP) zur Auflösung. Für Peptide, die zur Aggregation neigen, Geben Sie zunächst 6 M Guanidin·HCl oder 8 M Harnstoff hinzu (Harnstoff) um sie aufzulösen, und verdünnen Sie sie dann auf die erforderliche Konzentration.
veranschaulichen:
1. Um die Lagerung und spätere Verwendung zu erleichtern, Es wird empfohlen, das Peptid auf eine Konzentration von ca. aufzulösen 1-2 mg/ml.
2. Gewöhnliches gefriergetrocknetes Peptidpulver kann bei -20 °C länger als ein Jahr gelagert werden. Für gelöste Peptide, Es wird empfohlen, die Proben zu aliquotieren und bei -20 °C aufzubewahren; wenn die Peptidsequenz Methionin Met enthält (M), Cystein Säure Cys (C) oder Tyrosin Tyr (Y) Es wird empfohlen, es in einer sauerstofffreien Umgebung zu lagern, um Oxidation zu verhindern.
Beigefügte Aminosäureliste:
1.Neutrale Aminosäuren: Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Cystein, Methionin, Threonin, Serin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophansäure, Prolin, Asparagin und Glutamin
FEssen: Diese Art von Aminosäuremolekül enthält nur eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe
2.Saure Aminosäuren: Glutaminsäure, Asparaginsäure
Merkmale: Diese Art von Aminosäuremolekül enthält eine Aminogruppe und zwei Carboxylgruppen
3.Basische Aminosäuren: Lysin, Arginin, Histidin
Merkmale: Diese Art von Aminosäure enthält in ihrem Molekül eine Diaminocarboxylgruppe; Histidin hat einen Stickstoffring und ist schwach alkalisch, und ist ebenfalls eine basische Aminosäure.
