Uygun çözünme yöntemi peptit deneylerinin başarısı için önemli bir faktördür. Uygun olmayan çözünme, peptitlerin kaybına ve deneyin başarısız olmasına neden olur. Fakat, İdeal çözünme yöntemini bulmak bazen oldukça zordur. Aşağıda MOL Değişikliklerinin iki teknik grubu tarafından önerilen çözünme yöntemleri yer almaktadır.. yöntem
MOL Teknoloji Grubu Fesih Kılavuzunu Değiştirdi
Peptit çözünmesindeki temel problem ikincil yapının oluşmasıdır..
Hidrofobik peptid zincirlerinin ikincil yapılarının oluşumu daha belirgin olmasına rağmen, en kısa peptid zincirleri hariç, bu fenomen hemen hemen tüm peptid zincirlerinde meydana gelir, polariteden bağımsız olarak. Öyleyse, Polipeptitleri çözmenin ilk prensibi, steril damıtılmış su veya Deiyonize su kullanmaktır. (veya koşullar izin veriyorsa oksijensiz su).
Peptit çözeltisi bakteriyel bozulmayla karşılaşabilir. Bu fenomeni önlemek için, peptid steril damıtılmış su içinde çözülmelidir, veya gözenek büyüklüğüne sahip bir filtre membranı ile filtrelenir 0.45 veya 0.2 sterilizasyon için μm. Cys içeren polipeptitler, Buluştu, ve Trp oksidasyona özellikle duyarlıdır, bu yüzden oksijensiz suda çözülmeleri gerekir. İnert gazların enjekte edilmesiyle azaltılmış basınç altında gazın giderilmesiyle oksijensiz su elde edilebilir (azot, helyum, ve argon).
Peptit saf suda çözünmezse, ultrasonik işlem parçacıkların parçalanmasına ve çözünürlüğün artmasına yardımcı olabilir. Not: Ultrasonik tedavi, çözeltinin ısınmasına ve peptidin bozulmasına neden olur.
Peptit birden fazla temel amino asit içeriyorsa, %1~10 asetik asit sulu çözeltisi kullanın; çok hidrofobik peptitler için, kullanmak 50% asetik asit.
Polipeptit büyük miktarda asidik amino asit içeriyorsa, bir şekilde çözülebilir 1 ile 10% amonyak çözeltisi veya etil morfin asetat veya bikarbonat gibi uçucu bir alkalin tampon. Kromatografiden önce pH değeri ayarlanmalıdır.
Peptit kolona yüklenecekse, organik çözücü miktarı çok az olmalıdır, aksi takdirde saklama süresi ciddi şekilde etkilenecektir.
Polipeptit, Val gibi aromatik hidrokarbon yan zincirleri içerdiğinden dolayı oldukça hidrofobik ise, Leu, Buluştu, Phe, Tyr, Ala, vesaire., veya nötr bir peptiddir, DMF veya DMSO gibi membran denatüranlarının kullanılması polipeptidin çözülmesine yardımcı olabilir:
A. Yüksek konsantrasyonlu membran denatürantları, polipeptidin ikincil yapısını yok ederek çözünmesine yardımcı olur..
B. Membran denatürantları peptid analiz solüsyonlarının hazırlanması için uygundur, ancak biyolojik aktivitelerine ilişkin araştırmalara müdahale edebilir.
C. DMF en iyi denatürandır (ulaşabileceği en yüksek konsantrasyon 30%), ve peptit çözünene kadar damla damla eklenir..
D. Ters fazlı kromatografi sırasında, DMF, eluent'in ön zirvesiyle birlikte dışarı akacaktır.. Enjeksiyon hacmine bağlı olarak, tepe değeri çok yüksek olabilir. Çoğu peptid, büyük miktarda DMF elüsyonundan sonra birkaç dakika içinde elüte olabilir.. Peptit zinciri küçükse ve çok erken ayrışıyorsa, Peptit miktarı azaltılacak.
MOL, Teknik Grup II Fesih Kılavuzunu Değiştirdi
Amino asitlerin nötr olup olmadığı nasıl ayırt edilir, asidik veya alkali, ve çözünme yöntemini hesaplayın:
1. Aspartik asit Asp dahil olmak üzere polipeptit dizisindeki her asidik amino asidi atayın (D), glutamik asit Glu (e) ve C-terminal karboksil-COOH olarak -1; arginin Arg dahil her temel amino asit ( R), lizin Lys (k), histidin Onun (H) ve N-terminal amino-NH2'ye şu değer atanır: +1; nötr amino asitler 0. Buna dayanarak, polipeptidin tamamının değeri hesaplanır, ve puan pozitiftir Negatif puana sahip peptitlere temel peptitler denir, negatif puana sahip olanlara asidik peptitler denir, ve sıfır puana sahip olanlara nötr peptitler denir.
2. Alkali bir peptid ise, önce suyla eritmeye çalışın; eğer çözülemiyorsa, kullanmayı dene 10% – 30% asetik asit; eğer peptit hala çözünemiyorsa, saf asetik asit ve trifloroasetik asit TFA kullanmaya çalışın (<50 ul) onu eritmek, ve ardından peptid çözeltisini istenen konsantrasyona kadar seyreltin.
3. Asidik bir peptid ise, önce suyla eritmeye çalışın; su ile çözülemiyorsa, kullanmayı dene 13% amonyak suyu (v/v) onu eritmek, ve peptid çözeltisini gerekli konsantrasyona kadar seyreltin. Peptit dizisi sistein Cys içeriyorsa (C), alkali çözeltide çözülemez. Lütfen aşağıdaki yöntemleri deneyin.
4. Nötr peptitler genellikle organik çözücülerde çözülür. Birinci, asetonitril kullanmayı dene (asetonitril), veya metanol (metanol) veya izopropanol (izopropanol) çözünmek; çok hidrofobik peptitler için, önce az miktarda dimetil sülfoksit ile çözün (DMSO) ve gerekli konsantrasyona kadar su ile seyreltin; Peptit dizisi sistein Cys içeriyorsa (C), dimetilformamid kullan (DMF) veya N-metilpirolidon (NMP) çözünme için. Toplanmaya eğilimli peptitler için, ilk önce 6M guanidin·HCl veya 8M üre ekleyin (Üre) onları eritmek, ve daha sonra bunları gerekli konsantrasyona kadar seyreltin.
göstermek:
1. Depolamayı ve daha sonraki kullanımı kolaylaştırmak için, Peptitin yaklaşık olarak bir konsantrasyona kadar çözülmesi tavsiye edilir. 1-2 mg/ml.
2. Sıradan peptit dondurularak kurutulmuş toz -20°C'de bir yıldan fazla saklanabilir. Çözünmüş peptidler için, -20°C'de bölünerek saklanması tavsiye edilir; Peptit dizisi metiyonin Met içeriyorsa (M), sistein Asit Cys (C) veya tirozin Tyr (e) Oksitlenmeyi önlemek için oksijensiz bir ortamda saklanması tavsiye edilir.
Ekli amino asit listesi:
1.Nötr amino asitler: glisin, alanin, lösin, izolösin, valin, sistein, metiyonin, treonin, serin, fenilalanin, tirozin, triptofan asit, prolin, asparajin ve glutamin
Fözellikler: Bu tip amino asit molekülü yalnızca bir amino grubu ve bir karboksil grubu içerir
2.Asidik amino asitler: glutamik asit, aspartik asit
Özellikler: Bu tip amino asit molekülü bir amino grubu ve iki karboksil grubu içerir
3.Temel amino asitler: lizin, arginin, histidin
Özellikler: Bu amino asit türü molekülünde bir diaminokarboksil grubu içerir.; histidin bir nitrojen halkasına sahiptir ve zayıf alkalindir, ve aynı zamanda temel bir amino asittir.
