تعد طريقة الذوبان المناسبة عاملاً مهمًا لنجاح تجارب الببتيد. سيؤدي الذوبان غير السليم إلى فقدان الببتيدات وفشل التجربة. لكن, أحيانًا يكون العثور على طريقة الذوبان المثالية أمرًا صعبًا للغاية. فيما يلي طرق الحل التي اقترحتها المجموعتان الفنيتان لتغييرات MOL. طريقة
دليل حل مجموعة تكنولوجيا MOL
المشكلة الرئيسية في انحلال الببتيد هي تكوين البنية الثانوية.
على الرغم من أن تكوين الهياكل الثانوية لسلاسل الببتيد الكارهة للماء أكثر وضوحًا, باستثناء أقصر السلاسل الببتيدية, تحدث هذه الظاهرة في جميع السلاسل الببتيدية تقريبًا, بغض النظر عن القطبية. لذلك, المبدأ الأول لحل البوليببتيدات هو استخدام الماء المقطر المعقم أو الماء منزوع الأيونات (أو الماء الخالي من الأكسجين إذا سمحت الظروف بذلك).
قد يواجه محلول الببتيد تدهورًا بكتيريًا. لتجنب هذه الظاهرة, يجب أن يذوب الببتيد في الماء المقطر المعقم, أو يتم ترشيحه بغشاء مرشح بحجم مسام يبلغ 0.45 أو 0.2 ميكرومتر للتعقيم. الببتيدات التي تحتوي على Cys, التقى, و Trp معرضون بشكل خاص للأكسدة, لذا يجب إذابتها في الماء الخالي من الأكسجين. يمكن الحصول على المياه الخالية من الأكسجين عن طريق تفريغ الغازات تحت ضغط منخفض عن طريق حقن الغازات الخاملة (نتروجين, هيليوم, والأرجون).
إذا كان الببتيد غير قابل للذوبان في الماء النقي, العلاج بالموجات فوق الصوتية يمكن أن يساعد في تفتيت الجزيئات وزيادة الذوبان. ملحوظة: العلاج بالموجات فوق الصوتية سوف يسبب تسخين المحلول وتدهور الببتيد.
إذا كان الببتيد يحتوي على أحماض أمينية أساسية متعددة, استخدام 1 ~ 10٪ محلول مائي من حمض الأسيتيك; للببتيدات الكارهة للماء للغاية, يستخدم 50% حمض الخليك.
إذا كان البولي ببتيد يحتوي على كمية كبيرة من الأحماض الأمينية الحمضية, يمكن حله في 1 ل 10% محلول الأمونيا أو محلول قلوي متطاير مثل أسيتات إيثيل المورفين أو بيكربونات. يجب تعديل قيمة الرقم الهيدروجيني قبل اللوني.
إذا كان سيتم تحميل الببتيد على العمود, يجب أن تكون كمية المذيب العضوي صغيرة جدًا, وإلا فإن وقت الاحتفاظ سوف يتأثر بشكل خطير.
إذا كان البولي ببتيد كارهًا للماء بدرجة كبيرة لأنه يحتوي على سلاسل جانبية هيدروكربونية عطرية مثل Val, ليو, التقى, في, صور, علاء, إلخ., أو هو الببتيد محايد, يمكن أن يساعد استخدام مواد تشويه الغشاء مثل DMF أو DMSO في إذابة البولي ببتيد:
أ. تساعد مواد مشوهة الغشاء عالية التركيز على إذابة البولي ببتيد عن طريق تدمير بنيته الثانوية.
ب. تعتبر مواد تمويه الغشاء مناسبة لإعداد محاليل تحليل الببتيد, ولكنها قد تتداخل مع الأبحاث المتعلقة بنشاطها البيولوجي.
ج. DMF هو أفضل مزيل للطبيعة (أعلى تركيز يمكن أن يصل إليه 30%), ويضاف قطرة قطرة حتى يذوب الببتيد.
د. أثناء كروماتوجرافيا الطور العكسي, سوف يتدفق DMF مع القمة الأمامية للشاطف. اعتمادا على حجم الحقن, قد تكون قيمة الذروة عالية جدًا. يمكن أن أزل معظم الببتيدات في غضون دقائق قليلة بعد كمية كبيرة من أزل DMF. إذا كانت سلسلة الببتيد صغيرة ويتم التخلص منها مبكرًا جدًا, سيتم تقليل كمية الببتيد.
دليل حل المجموعة الفنية الثانية من MOL
كيفية التمييز ما إذا كانت الأحماض الأمينية محايدة, حمضية أو قلوية, وحساب طريقة الذوبان:
1. تعيين كل حمض أميني حمضي في تسلسل متعدد الببتيد بما في ذلك حمض الأسبارتيك Asp (د), حمض الجلوتاميك جلو (ه) و C- محطة الكربوكسيل-COOH مثل -1; كل الأحماض الأمينية الأساسية بما في ذلك أرجينين أرج ( ر), ليسين ليز (ك), الهستيدين له (ح) ويتم تعيين قيمة لـ N-terminal amino-NH2 +1; الأحماض الأمينية المحايدة هي 0. بناء على هذا, يتم حساب قيمة البولي ببتيد بأكمله, والنتيجة إيجابية تسمى الببتيدات ذات النتيجة السلبية الببتيدات الأساسية, أولئك الذين لديهم درجة سلبية يطلق عليهم الببتيدات الحمضية, وتلك التي حصلت على درجة صفر تسمى الببتيدات المحايدة.
2. إذا كان الببتيد القلوي, حاول حله بالماء أولاً; إذا كان لا يمكن حله, حاول أن تستخدم 10% - 30% حمض الخليك; إذا كان الببتيد لا يزال غير قابل للذوبان, حاول استخدام حمض الأسيتيك النقي وحمض ثلاثي فلورو أسيتيك TFA (<50 ميكرولتر) لحلها, ثم قم بتخفيف محلول الببتيد إلى التركيز المطلوب.
3. إذا كان الببتيد الحمضي, حاول حله بالماء أولاً; إذا لم يكن من الممكن حله بالماء, حاول أن تستخدم 13% ماء الأمونيا (الخامس / الخامس) لحلها, وتمييع محلول الببتيد إلى التركيز المطلوب. إذا كان تسلسل الببتيد يحتوي على السيستين Cys (ج), لا يمكن حله في محلول قلوي. يرجى تجربة الطرق أدناه.
4. عادة ما يتم إذابة الببتيدات المحايدة في المذيبات العضوية. أولاً, حاول استخدام الأسيتونيتريل (الاسيتو الانيتريل), أو الميثانول (الميثانول) أو الأيزوبروبانول (الأيزوبروبانول) ليذوب; للببتيدات الكارهة للماء للغاية, قم أولاً بإذابة كمية صغيرة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) ويخفف بالماء حتى التركيز المطلوب; إذا كان تسلسل الببتيد يحتوي على السيستين Cys (ج), استخدم ثنائي ميثيل فورماميد (دمف) أو ن- ميثيل بيروليدون (نمب) للحل. للببتيدات المعرضة للتجمع, قم أولاً بإضافة 6 م جوانيدين · حمض الهيدروكلوريك أو 8 م يوريا (اليوريا) لحلهم, ومن ثم تخفيفها إلى التركيز المطلوب.
يوضح:
1. وذلك لتسهيل التخزين والاستخدام اللاحق, يوصى بإذابة الببتيد إلى تركيز حوالي 1-2 ملغم/مل.
2. يمكن تخزين مسحوق الببتيد العادي المجفف بالتجميد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لأكثر من عام واحد. للببتيدات الذائبة, فمن المستحسن لقسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية; إذا كان تسلسل الببتيد يحتوي على ميثيونين ميت (م), حمض السيستين Cys (ج) أو التيروزين صور (ي) يوصى بتخزينه في بيئة خالية من الأكسجين لمنع الأكسدة.
قائمة الأحماض الأمينية المرفقة:
1.الأحماض الأمينية المحايدة: جليكاين, ألانين, لوسين, آيزوليوسين, حمض أساسي, السيستين, ميثيونين, ثريونين, سيرين, فينيل ألانين, التيروزين, حمض التربتوفان, برولين, الأسباراجين والجلوتامين
فأكل: يحتوي هذا النوع من جزيء الأحماض الأمينية على مجموعة أمينية واحدة ومجموعة كربوكسيل واحدة فقط
2.الأحماض الأمينية الحمضية: حمض الجلوتاميك, حمض الأسبارتيك
سمات: يحتوي هذا النوع من جزيء الأحماض الأمينية على مجموعة أمينية واحدة ومجموعتين من الكربوكسيل
3.الأحماض الأمينية الأساسية: يسين, أرجينين, الهستيدين
سمات: يحتوي هذا النوع من الأحماض الأمينية على مجموعة ديامينوكربوكسيل في جزيئه; يحتوي الهستيدين على حلقة نيتروجين وهو قلوي ضعيف, وهو أيضًا حمض أميني أساسي.
