GLP-1 不純物分析用のプラットフォーム HPLC メソッドが失敗する理由

GLP-1 不純物分析用のプラットフォーム HPLC メソッドで実際に測定できるものと測定できないもの

プラットフォーム逆相グラジエントは、主に全体的な疎水性とアクセス可能な非極性表面によってペプチドを分離します。, 配列同一性によるものではない, そのため、単一残基の置換​​または位置異性体によって生物学的活性が大幅に変化する一方で、ピークの広がりや吸着の変動よりも小さな保持変化が生じる可能性があります。 (ウォーターズのペプチドメソッド開発入門書). この方法で測定されるのは、ウィンドウ内にどれだけのペプチド含有物質が溶出するかです。. 測定できないのは、その物質がどの分子であるかということです.

検出により限界がさらに高まる. 検出場所 214 nm はペプチド骨格のアミド結合に応答するため、配列変異体や切断型を含む本質的にすべてのペプチド含有種に応答します。, 反応は芳香含有量にあまり依存しません。 280 nm; 280 nmは主にTrpを検出します, Tyr と Phe があり、それらが欠けている不​​純物が過小評価される可能性があります (ウォーターズのペプチドメソッド開発入門書). あ 280 したがって、nm のみの方法には検出の盲点があります。 214 nmメソッドはそうではありません.

ペプチドメソッドに求められる 4 つのクレーム

純度, 身元, 内容と安定性は 4 つの別々の主張です, 1 つの未検証のクロマトグラフィー ピーク面積結果では、4 つすべてが確立されません。. 純度は、統合された領域のどれだけがメインピークに属するかを示す相対的な尺度です。, そしてそれ自体はアイデンティティについて何も語らない: サンプルで読める 99% HPLC では純粋であるが、依然として間違った分子である. アイデンティティは大衆によって確立される, ペプチドマッピング, アミノ酸分析またはNMR, そして EMA合成ペプチドガイドライン リリース時の識別には少なくとも 2 つの直交する方法を推奨します, 組み合わせを示す責任のある出願人が配列を明確に確認していること.

含有量は存在するペプチドの量です, 通常、参照標準に対して表現され、対イオンについて補正されます。, 水と塩. 安定性は分子と同様にメソッドの特性でもあります: 質問1A(R2) 検証された安定性を示す手順を使用し、保管中に変化しやすい特性を調べるための安定性研究が必要です, 分解生成物と経路を特定するストレステスト付き (質問1A(R2)). 強制分解種を分解することが示されていない精製方法は、安定性を示す方法ではありません, システム適合性の結果が何であれ.

なぜ構造的に類似した GLP-1 ペプチドとその不純物が一般的な逆相グラジエントに打ち勝つのか

GLP-1 ペプチド間の構造類似性は、必ずしもクロマトグラフィー挙動の類似につながるとは限りません。, このため、プラットフォーム手法では化合物固有の最適化が必要となる場合があります。 (構造の類似性はクロマトグラフィーの挙動を予測しないというサーモ フィッシャーの主張). 同じ情報源は、移動相の組成が固定相の化学反応よりも不純物の分離に大きな影響を与えたと報告しています。, また、TFA を含む移動相は、多くの場合、ギ酸よりも優れたピーク形状と分離能を示します。.

グラジエントが変化しない場合でも、カラムの化学反応により答えが変わります。. 単一のメソッドとグラデーションについて, CORTECS Premier C18+ および ACQUITY Premier Peptide CSH C18 は、最もユニークなリラグルチド変異体を分離しました, 一方、CORTECS Premier C18+ および ACQUITY Premier CSH フェニルヘキシルは、最もユニークなセマグルチド変異体を分離しました。; ペプチド CSH C18 はセマグルチドよりもリラグルチドをよりよく分離しましたが、フェニル-ヘキシル カラムはその逆を行いました。 (ウォーターズのリラグルチドとセマグルチドのカラム選択の比較). 単一の最高のコラムはありません, 指定された分析物に最適なカラムのみ.

選択性を無効にする不純物クラス

不純物のクラスは、分子をどの程度変化させるか、またその変化が逆相グラジエントで見えるかどうかが異なります。. 以下の質量変化はサードパーティのペプチド試験文書からのものであり、化学的性質を説明しています。, 公定上の制限ではない.

選択性だけが故障モードではない. ペプチド HPLC メソッドも、シリカへの吸着や非特異的結合により失敗します。, 残留シラノール, 金属表面, フリット, チューブ, バイアルとフィルター; pHによる凝集と沈殿による, イオン強度, 温度, 溶媒, 濃縮または凍結融解; 二次的な固定相相互作用によりテーリングを生成, 分裂または非溶出; 特にAspの金属媒介吸着による- およびグル含有種; キャリーオーバーとメモリー効果による; そしてカラム上の分解により (ペプチド HPLC の失敗モードのレビュー). メソッドはすべての選択性チェックに合格しても、分析対象物がシステムに失われる可能性があります。.

温度と移動相は一方通行のレバーではありません

カラム温度を上げると反射的に修正されます, そしてそれは信頼できません. カラム温度をから上昇させる 30 ℃～ 60 °C により、低温で共溶出した 2 つのチルゼパチド不純物が分解されました, しかし、Hypersil GOLD C4 カラムと TFA 含有移動相を使用したセマグルチドでは、同じ温度上昇により分解能が低下し、2 つの不純物が共溶出しました。 (Thermo Fisher のセマグルチドとチルゼパチドの RPLC-UV 最適化研究). 効果の方向はカラムと移動相の組み合わせによって異なります, 一般的なルールではない.

ウォーターズの温度研究では、1 つの方法内で同じ非単調な挙動が示されています。: カラム温度が ±5 °C 変化すると、リラグルチドの不純物種の分離に影響を与える選択性の違いが生じました。, チルゼパチドとセマグルチド, 1 つの重要なペア間で最高の解像度が得られる (ピーク 9 そして 10) で 55 °C でこれら 2 種が共溶出 65 ℃ (ある ホブト合成 GLP-1 分離における温度依存性に関するウォーターズの研究). 5度の変化により、重要なペアが解決済みから共溶出状態に移行しました, これは研究室間の移動が生き残るために必要なマージンです.

UV エリア パーセントが防御可能な純度の数値ではなくなる場所

エリアの正規化は運用上の純度の尺度です. 質量またはモル分率に変換するには、適切な応答係数の仮定が必要です, 検出範囲と統合. 異なる残基組成またはラベルは異なる反応をする可能性があります, 未検出または共溶出する種についてはさらなる評価が必要です.

検出波長によって、どの不純物が計算に含まれるかが決まります. なぜなら 280 nmは主にTrpを検出します, テュールとフェ, これらの残基が欠けている不​​純物は、その波長では過小評価されたり、見えなくなったりする可能性があります。, その間 214 nm は本質的にすべてのペプチド含有種に応答します (ウォーターズのペプチドメソッド開発入門書). EMA の要件に照らして、方法が次の目的に適していることを確認してください。 0.1% レポートしきい値, ある 280 nm のみのメソッドでは、ガイドラインでは許容されていない非芳香族ペプチド関連不純物の検出ギャップが存在します。.

共溶出の結果

EMA ガイドラインは、1 つのピークとして一緒に観察される不純物と、独立した手法の必要性の可能性を扱います。. 関連する資格評価を測定された複合レベルに適用する; 解釈しないでください 1.0% 個人のアイデンティティを見逃す許可としてのしきい値、またはレポートのしきい値の変更として.

実際のケースは十分に文書化されています. ペプチドは読み取ることができます 98% HPLCでは純粋ですが、 +16 サテライトピーク, 部分酸化、メインピークと共溶出, UVでは見えず、質量ではっきりと見える. 熱ストレスを受けたエクセナチドの LC-UV/MS 作業により、ピーク面積が大幅に増加した 7 つのピークが見つかりました。, 質量検出器が +16 -1.3 分の保持時間シフトにおける Da 酸化の差と、非酵素的切断フラグメント 3,254.1 そして (ストレスを受けたエクセナチドの LC-UV/MS 不純物プロファイリング). UV トレースだけでは、質量データと矛盾する純度数値が報告されたでしょう。.

プラットフォームメソッドに依存する前に、新しいシーケンスの目的に適しているかどうかを確認する方法

資格は目的から始まる, メソッドからではなく. ICH Q14 では、分析ターゲット プロファイルを、分析測定の意図された目的と予想されるパフォーマンス基準を説明するパフォーマンス特性の見通しの概要として定義しています。, また、ATP は分析技術の選択を推進し、手順が意図した目的に適合し続けることを保証するためにライフサイクル全体にわたって維持されると述べています。 (ICH Q14の分析対象プロファイル). 最初に新しいシーケンスの ATP を書き込みます, 次に、それに対してプラットフォーム メソッドをテストします.

このことから、3 段階の証拠の期待が得られます。. スクリーニングと特性評価は、制限が記録されている場合、柔軟性と不完全な堅牢性データを許容します; 初期の臨床試験または開発試験には、定義されたサンプル前処理による資格が必要です, 適切な特異性, 予備精度と精度, 使用可能な範囲と基本的なシステム適合性; リリース, 安定性と申請サポートのテストには、事前に定義された合格基準が必要です, 検証または認定されたパフォーマンス, アナリスト全体の堅牢性, 日数と装備, 管理された参照標準とメソッドが安定していることを示す証拠（必要な場合） (フェーズに適した分析制御戦略). あなたがいる階層が証拠を示します, ティアを上げるかどうかが決定事項です, メソッドの評判ではない.

ゲート基準

これらを順番に進めていきます, そして最初の失敗で停​​止します.

1. 使用目的が書いてある. ATP は測定する属性に名前を付けます, パフォーマンス特性と関連する基準, ICH Q14経由. 卸売ペプチド

2. 検出はレポートのしきい値に対して適切です. この方法は Ph を満たすのに適していなければなりません. ユーロ. 0.1% 合成ペプチドの報告閾値, ごとに EMA合成ペプチドガイドライン. あ 280 nm のみの方法では、非芳香族種の場合はこのゲートに合格しません.

3. 特異性は 3 つの ICH Q2 のいずれかによって実証されます。(R2) ルート. 干渉がないこと, 直交手続きとの比較, またはその手順の基礎となる科学的原理; 手順が特定的でない場合でも選択性を実証できる (I Q2(R2)).

4. 反応要因に対処する 反応が基準物質と異なる不純物に対して, ICH Q2経由(R2).

5. 安定表示能力を発揮 強制劣化による, ICH Q1A経由(R2).

6. システム適合性は手順により設定されます, 章からは想定されていない. 米国薬局 <621> 完全な分析システムが分析前および分析全体にわたって適切に機能することを実証する必要がある, モノグラフまたは分析手順によって設定された基準による; 調和されたチャプタでは、次のピーク対称性要件が追加されます。 0.8 に 1.8 半値のピーク幅から分解能を計算します (米国薬局 <621> システム適合性). システム適合性を通過することが必須条件です, 目的に適していない.

ストレスを加えてスパイクしたサンプルを使用してメソッドに挑戦する

強制的な劣化とスパイクはゲートチェックリストを証拠に変えるものです. AQbD エクセナチド研究では 4 つのパラメータをスクリーニングしました (カラム化学, 有機改質剤, 酸性修飾剤, 勾配時間), 検出され、部分的に解決されました 19 プロセス- および生成物関連の不純物ピーク, そして、最終的な MODR 検証クロマトグラムを作成しました。 20 の積分面積でのピーク 0.05% 以上, 少なくとも USP 解像度の最適化目標に対して 1.5 特定された製品関連の不純物の大部分について (AQbD エクセナチドメソッド開発研究). それらの 20 ピークは検出されたピークです, 制限ではない, との間のギャップ 19 上映会と 20 検証では、その方法を信頼するのではなく、挑戦することが重要です. ペプチドのカイザーテスト

最適化だけで十分な場合, そして具体的に何を変えるのか

もっともらしい変更が分析目標プロファイルを満たすことができる場合に最適化する. パラメーターを変更すると、選択性だけでなく保持力や効率も変化する可能性があります. 得られた証拠が依然として不十分な場合は、直交手順を追加するか、方法を再設計します。.

何を変えるのか, 順番に

実際の重要なペアに対して構造化された最適化計画を選択する. 移動相, 固定相, 勾配と温度は相互作用します; 1 つのベンダーの比較では、必須の変更順序や普遍的な勾配の傾きが確立されません。.

直交的な手法または化合物固有のメソッド開発が必要な場合

すべてのペプチド関連不純物を分離できない場合は、直交技術が必要です, それは EMA合成ペプチドガイドライン は、追加の独立した方法が必要になる可能性があり、共溶出する不純物が以下に該当すると述べて予想しています。 1.0% 正当な理由がない限り、資格の基準値. これは理論的な規定ではありません. 同じエクセナチド研究では、RPLC が浅い反応を必要とする脱アミド化ペアを示しています。 0.5% 有機毎分勾配以上 114 ピークフロンティングによる部分的な解決のみの場合は数分, BEH Amide HILIC は、 150 mm, BEH HILIC は部分的な解決を達成しました。 1% 1分あたりのオーガニック 45 分, 分析時間を半分にし、同時にスループットを2倍にします 100 mm カラムの長さ (ウォーターズのエクセナチドの RPLC/HILIC 直交プロファイリング研究).

直交モードの選択

プライマリ モードでは認識できないものから選択が決まります。. HILIC は、逆相ではベースライン解決できないバリアントを文書化して補完するものです。, HILIC 内ではモードが重要です: BEH Amide と BEH HILIC は同じ脱アミド化ペアで異なる挙動を示しました. 質量検出は、同一性と共溶出種を補完するものです, 質量検出器はメインの UV ピークの下にある不純物の特徴的な質量シフトを読み取ることができるため、. 質量検出の限界は、HRMS だけでは異性体不純物と同重体不純物を区別できないことです。, ラセミ化により親薬物と同じ質量の D-アミノ酸不純物が生成されるため, イオン対形成剤として使用される TFA は、質量分析計でのペプチドのイオン化を抑制します。 (GLP-1 分析の課題に関する LCGC インタビュー). 同じ盲点を共有する直交手法は直交ではありません.

化合物に特化した開発が正直な答えである場合

化合物固有の開発は、分析対象物に合わせてメソッドを再設計することなく、プラットフォーム パラメーターと直交モードのどの組み合わせによっても ATP を満たすことができない場合の正直な答えです。. 証拠はクラス全体がその方向にあることを示しています: Thermo Fisher の研究では、メソッドの最適化は化合物ごとに行う必要があり、ユニバーサル プラットフォームメソッドはさまざまな GLP-1 受容体アゴニストに直接適用できないと結論付けています。, 各分析物に合わせたクロマトグラフィー条件を使用 (Thermo Fisher のセマグルチドとチルゼパチドの RPLC-UV 最適化研究). 規制の枠組みは、ICH Q14 を通じてこれに対応しています。, これにより最小限のことが可能になります (伝統的) アプローチまたは強化されたアプローチの要素, 事前知識とリスク評価を使用した強化されたアプローチにより、影響力のあるパラメーターを特定し、単変量または多変量研究を通じて MODR を確立します。 (問14). プラットフォームの知識が出発点です; ATPがどれだけ遠くまで運ぶかを決定する.

比較可能性の主張が審査に耐えられるように、転送と記録のパッケージに記載する必要があるもの

ペプチドのメソッド移転は、小分子の移転では許容される細部では失敗します. システムの滞留容積の違いは頻繁に発生します。, ペプチド分離は非常に浅いグラジエントに依存しているため、転写失敗の原因として過小評価されています, また、大きな分子はよりゆっくりと拡散するため、カラムの温度と流速は、小さな分子よりもペプチドの場合により重要です。 (GLP-1 メソッド移転に関する LCGC 実務家によるディスカッション). 浅い勾配により、楽器間のあらゆる音量差が増幅されます。.

記録では、独立した査読者が各研究室が行ったことを再構築できるようにする必要があります. つまり、メソッドの ID とバージョン; カラムメーカー, 化学, 寸法, 粒子と細孔サイズ, シリアル番号またはロット番号, コンディショニングの歴史, 噴射回数, 保管および交換の基準; 機器および検出器のIDとソフトウェアおよびファームウェアのバージョン; 測定方法および適用された補償を使用して測定または認定された滞留容積; カラムオーブンとオートサンプラーの設定値と実際に記録された温度および平衡時間; 溶媒および試薬グレードを含む移動相調製の詳細, サプライヤーとロット番号, 水源, pHおよび調整試薬, 準備日時, 作成者と検証者, 濾過と脱気, 保存容器と有効期限または保持時間 (FDA の比較可能性と方法移転への期待).

データ整合性レイヤー

記録は、基礎となるデータが ALCOA の期待を満たしている場合にのみ防御可能です。. MHRA は ALCOA を帰属可能と定義, 読みやすい, 同時代の, オリジナルで正確な, プラスは完了を意味します, 一貫性のある, 永続的で利用可能な, そして、生データは活動の完全な再構築を可能にしなければならないこと、およびデータが動的状態で取得され、電子的に生成された場合であることを述べています。, 紙のコピーは生データとみなされません (クロマトグラフィー生データに対する MHRA の ALCOA の期待). クロマトグラフィーの場合、これは特有です: 印刷されたクロマトグラムはデータを再処理してベースラインを拡張する機能を失います。, これはまさに、共溶出に関する質問が生じたときにレビュー担当者が必要とする能力です。.

接続されたデータ パッケージが役立つ場合

引き継ぎ時の実質的な失敗は、ドキュメントが見つからないことではなく、ドキュメント間の接続が欠けていることです。. メソッドのバージョンが, コラムロット, 滞留容積の測定と統合の決定は別のファイルに保存されます, レビュー担当者は、元の研究室に問い合わせずに実行を再構築することはできません, そして比較可能性の主張は科学ではなく通信で行き詰まっている. メソッドレコードを保持する接続されたデータパッケージ, 同じサンプルと実行識別子にリンクされている機器記録と生のクロマトグラフィー データにより、再構成ステップが削除されます。. それが狭いです, このようなパッケージがここで果たす実際的な役割: 査読者は何度も質問することなく再構築が可能になります.

方法に関する質問をファイリングに関する質問に変えるよくある間違い

最初の間違いは、システムの適合性を目的への適合性として扱うことです. 米国薬局 <621> 適切に機能するには完全な分析システムが必要です, 手順によって設定された基準を使用して, 普遍的な解像度値を課すものではありません (米国薬局 <621> システム適合性). 合格適合性は、システムが今日動作していることを示します, そのメソッドが意図した質問に答えているわけではありません.

2 つ目は、UV 純度の数値を同一性または完全性の主張として読み取ることです。. 分離されたピークは特定されたピークではありません, そして 98% 面積パーセントは残りの証拠ではありません。 2% 良性です. 3 番目は、分離されたピークが単一種であると仮定します。: 共溶出する不純物が 1 つのピークとして観察されます。 1.0% 別途正当な理由がない限り、資格の基準値 (EMA合成ペプチドガイドライン). 4 番目は、社内移転が成功したということは、そのメソッドが移転可能であることを意味すると仮定しています。, ドウェルボリュームと浅い勾配により機器間の選択性が変化する場合 (GLP-1 メソッド移転に関する LCGC 実務家によるディスカッション).

よくある質問

システム適合性に合格するということは、プラットフォームのメソッドが目的に適合していることを意味しますか?

いいえ. 米国薬局 <621> 完全な分析システムが分析前および分析全体にわたって適切に機能することを実証する必要がある, ユニバーサル解像度値は設定されません; 基準はモノグラフまたは分析手順に基づいています (米国薬局 <621> システム適合性). 目的に適合するかどうかは別の問題です, ICH Q14で定義された分析対象プロファイルに対して回答しました (問14).

UV 面積パーセントはリリース仕様の純度数値として使用できますか?

純度の尺度として機能します, しかし無資格者としてではない. 面積の正規化は、モルあたりの同等の応答を想定しています, そして私はQ2(R2) 分析物の応答が標準物質と異なる場合に相対応答係数を計算するよう指示します (I Q2(R2)). 検出波長は、どの種を計算に含めるかも設定します, 以来 280 nmは主にTrpを検出します, テュールとフェ (ウォーターズのペプチドメソッド開発入門書).

最適化するか直交化するかをどうすれば知ることができますか?

問題がパラメータ範囲にあり、重要なペアが移動相に応答する場合に最適化します。, カラム化学, 温度または勾配の傾き. ペアがそれらのいずれにも応答しない場合は直交に移行します, エキセナチドのプロリン挿入バリアントと同様に、HILIC が Rs = に達する一方で、広範な最適化の後でも RPLC はベースラインを解決できませんでした。 2.94 (ウォーターズのエクセナチドの RPLC/HILIC 直交プロファイリング研究).

研究室間のペプチドメソッドの転送が失敗する原因?

ドウェルボリュームの違いは頻繁に発生する原因ですが、過小評価されています, ペプチドの分離は非常に浅い勾配に依存するため, カラムの温度と流量は、小分子よりもペプチドにとって重要です。 (GLP-1 メソッド移転に関する LCGC 実務家によるディスカッション). したがって、移動記録には、測定された滞留容積と測定方法を記載する必要があります。, コラムロットと一緒に, コンディショニング履歴と移動相調製の詳細 (FDA の比較可能性と方法移転への期待).

結論

決定は正しい順序で尋ねられる 1 つの質問にかかっています: 意図された目的には何が必要ですか, プラットフォームのメソッドはそれを満たしていますか? 最初に分析ターゲットのプロファイルを作成します, ICH Q14経由, 次に、EMA に対してメソッドをテストします。 0.1% レポートしきい値, ICH Q2(R2) 特異性を証明するためのルート, 安定性を示す能力の強制劣化の証拠. このメソッドがそれらのゲートをクリアした場合, そのまま使用し、制限を記録します. パラメータ範囲で失敗した場合, 重要な順序で最適化する: 移動相, カラム化学, 温度, その後勾配勾配. 選択性に失敗した場合, 同じ死角を共有しない直交モードを追加します. 分析対象物に基づいてメソッドを再構築しないと ATP を満たすことができない場合, 化合物に特化した開発に取り組む, これはクラスレベルの証拠が裏付けているものです.

転送パッケージは、他の誰かによって決定がテストされる場所です. 滞留容積測定を実施, カラムロットとコンディショニング履歴, 移動相調製記録と生の電子データ, MHRA の再構築要件は審査担当者が適用するものであるため. 次のステップは、目の前のシーケンスの ATP を取得し、6 つのゲート基準に対して実行することです。; その評価について第二の視点が必要な場合, 方法を出願する前に専門家に相談する.

ゼジュン・ペン

最高技術責任者; ペプチド合成のエキスパート コアの専門知識: 複雑なペプチド合成, 非天然アミノ酸修飾, 環状ペプチドとステープルペプチドの構築.

著者について 最新の投稿

バイオグラフィー:Zejun Peng は有機化学とペプチド合成において豊富な経験を持っています. 彼は固相ペプチド合成の組み合わせ応用に熟達しています。 (SPSS) および液相ペプチド合成 (LPPS), 特に「合成が非常に難しいシーケンス」を克服することに長けています。 (超長鎖ペプチドなど, 疎水性の高い配列, および複数のジスルフィド結合の折り畳み). 彼のリーダーシップの下で, チームはいくつかの特殊な変更で技術的なボトルネックを克服することに成功しました。 (N-メチル化など, PEG化, そして蛍光標識), 以上の合成成功率を維持する 98%.

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