用于 GLP-1 杂质分析的平台 HPLC 方法实际测量什么以及不测量什么
反相梯度平台主要通过整体疏水性和可接近的非极性表面来分离肽, 不是通过序列同一性, 因此，单个残基取代或位置异构体可以显着改变生物活性，同时产生小于峰展宽或吸附变异性的保留变化 (沃特世肽方法开发入门读物). 该方法测量的是在窗口中洗脱出多少含肽材料. 它不测量的是该材料是哪种分子.
检测复合极限. 检测于 214 nm 响应肽主链酰胺键，因此响应基本上所有含肽的物种，包括序列变体和截短, 与芳香族含量相比，响应的依赖性要小得多 280 纳米; 280 nm主要检测Trp, Tyr 和 Phe 可能会低估缺乏它们的杂质 (沃特世肽方法开发入门读物). 一个 280 因此，仅纳米方法存在检测盲点， 214 nm 方法不.
肽法要求携带的四项权利要求
纯度, 身份, 含量和稳定性是四个单独的声明, 并且一项未经验证的色谱峰面积结果不能确定所有四个. 纯度是积分面积中有多少属于主峰的相对度量, 它本身并没有说明身份: 样本可以读取 99% 通过 HPLC 纯化，仍然是错误的分子. 身份是通过大众建立的, 肽图谱, 氨基酸分析或核磁共振, 和 EMA 合成肽指南 建议至少两种正交方法在发布时进行识别, 申请人负责显示组合，明确确认序列.
含量是存在的肽的数量, 通常根据参考标准表示并针对反离子进行校正, 水和盐. 稳定性与分子一样是方法的一个特性: 我Q1A(R2) 需要进行稳定性研究，以使用经过验证的稳定性指示程序并检查在储存期间容易发生变化的属性, 通过压力测试识别降解产物和途径 (我Q1A(R2)). 从未被证明可以解决强制降解物质的纯度方法不是稳定性指示方法, 无论其系统适用性结果如何.
为什么结构相似的 GLP-1 肽及其杂质无法使用通用反相梯度
GLP-1 肽之间的结构相似性并不一定意味着相似的色谱行为, 这就是为什么平台方法可能需要特定于化合物的优化 (Thermo Fisher 的论点是结构相似性不能预测色谱行为). 同一来源报道称，流动相组成对杂质分离的影响比固定相化学的影响更大, 含 TFA 的流动相通常比甲酸具有更好的峰形和分辨率.
即使梯度不变，色谱柱化学也会改变答案. 关于单一方法和梯度, CORTECS Premier C18+ 和 ACQUITY Premier Peptide CSH C18 分离出最独特的利拉鲁肽变体, 而 CORTECS Premier C18+ 和 ACQUITY Premier CSH Phenyl-Hexyl 分离出了最独特的索马鲁肽变体; 肽 CSH C18 分离利拉鲁肽的效果优于索马鲁肽，而 Phenyl-Hexyl 柱则相反 (沃特世对利拉鲁肽和索马鲁肽的色谱柱选择比较). 没有单一的最佳列, 仅针对指定分析物的最佳色谱柱.
破坏选择性的杂质类别
杂质类别的不同之处在于它们改变分子的程度以及这种变化是否对反相梯度可见. 下面的质量变化来自第三方肽测试文件并描述了化学反应, 不是药典限度.
|
杂质等级 |
质量转移 |
为什么反相会遇到困难 |
|---|---|---|
|
氧化 (蛋氨酸, 色氨酸, 半胱氨酸) |
+16 和 |
极性变化小; 通常在母体附近或下方洗脱 |
|
双重氧化 |
+32 和 |
第二次氧化事件, 累积保留位移 |
|
脱酰胺化 (天冬氨酸→天冬氨酸, 谷氨酰胺→谷氨酸) |
霍布特联轴器 +1 和 |
与母体接近等压; 经典的共洗脱案例 |
|
N端环化 (谷氨酰胺→焦谷氨酸) |
-17 是 |
多肽供应商 带电 N 末端的丢失会微妙地改变保留 |
|
删除 肽的 顺序 |
取决于缺失的残基和修饰 |
残渣缺失; 可能比母体具有更多或更少的疏水性 |
|
残留保护基团 (叔丁基, 铅, 特鲁特) |
从分子式计算净保留基团 |
不完全脱保护产生的疏水标签 |
选择性并不是唯一的失效模式. 肽 HPLC 方法也会因吸附和与二氧化硅的非特异性结合而失败, 残留硅烷醇, 金属表面, 油炸块, 管道, 小瓶和过滤器; 通过 pH 驱动的聚集和沉淀, 离子强度, 温度, 溶剂, 浓缩或冻融; 通过二次固定相相互作用产生拖尾, 分裂或不溶解; 通过金属介导的吸附，尤其是 Asp- 和含谷氨酸的物种; 通过残留和记忆效应; 并通过柱上降解 (肽 HPLC 失效模式的回顾). 一种方法可以通过所有选择性检查，但仍然会向系统丢失分析物.
温度和流动相不是单向杠杆
提高柱温是本能反应, 而且它不可靠. 提高柱温 30 °C 至 60 °C 分离了在较低温度下共洗脱的两种替泽帕肽杂质, 但对于使用 Hypersil GOLD C4 色谱柱和含 TFA 流动相的索马鲁肽，相同的温度升高会降低分辨率并同时洗脱两种杂质 (Thermo Fisher 针对索马鲁肽和替泽帕肽的 RPLC-UV 优化研究). 作用方向取决于色谱柱和流动相组合, 不符合一般规则.
沃特世温度研究显示一种方法内具有相同的非单调行为: ±5 °C 的柱温变化会产生选择性差异，影响利拉鲁肽杂质种类的分离度, 替泽帕肽和索马鲁肽, 具有一对关键对之间的最佳分辨率 (峰 9 和 10) 在 55 °C 和这两种物质共洗脱 65 ℃ (一个 霍布特合成 沃特世 GLP-1 分离中温度依赖性的研究). 五度的变化使关键对从解析变为共洗脱, 这是实验室之间的转移必须生存的余量.
紫外线面积百分比不再是一个可靠的纯度数字
面积归一化是一种操作纯度测量. 将其转换为质量或摩尔分数需要适当的响应因子假设, 检测覆盖率和集成. 不同的残留成分或标签可能会有不同的反应, 未检测到或共洗脱的物种需要进一步评估.
检测波长决定哪些杂质最终进入计算. 因为 280 nm主要检测Trp, 酪氨酸和苯丙氨酸, 缺乏这些残基的杂质在该波长下可能代表性不足或不可见, 尽管 214 nm 基本上对所有含肽物种都有反应 (沃特世肽方法开发入门读物). 阅读 EMA 要求，方法适用于 0.1% 报告门槛, 一个 280 仅纳米方法对非芳香族肽相关杂质存在检测差距，指南并未以此为借口.
共洗脱结果
EMA 指南解决了作为一个峰一起观察到的杂质以及可能需要独立方法的问题. 将相关资格评估应用于测量的综合水平; 不解释 1.0% 阈值作为忽略个人身份的许可或作为报告阈值的变化.
实际案例有据可查. 肽可以读取 98% 通过 HPLC 纯化，同时 +16 大卫星峰, 部分氧化与主峰共洗脱, 紫外线不可见，质量清晰可见. 对热应激艾塞那肽的 LC-UV/MS 工作发现了七个峰面积显着升高的峰, 与质量检测器分配 +16 Da 氧化差异为 -1.3 分钟保留时间偏移，非酶裂解片段为 3,254.1 和 (应激艾塞那肽的 LC-UV/MS 杂质分析). 单独的 UV 迹线会报告与质量数据相矛盾的纯度值.
在依赖平台方法之前，如何验证它是否适合新序列的用途
资格从预期目的开始, 不是来自方法. ICH Q14 将分析目标概况定义为描述分析测量的预期目的和预期性能标准的性能特征的前瞻性总结, 并指出 ATP 推动分析技术的选择，并在整个生命周期中进行维护，以确保程序始终适合预期目的 (ICH Q14 的分析目标概况). 首先写入新序列的 ATP, 然后针对它测试平台方法.
三层证据期望由此得出. 如果记录了限制，筛选和表征可以容忍灵活性和不完整的稳健性数据; 早期临床或开发测试需要通过规定的样品制备进行鉴定, 适当的特异性, 初步精度和准确度, 可用范围和基本系统适用性; 发布, 稳定性和归档支持测试需要预定义的验收标准, 经验证或合格的性能, 分析师的稳健性, 天数和装备, 受控参考标准和方法稳定性的证据——在需要时表明 (适合阶段的分析控制策略). 你所处的层级就是证据, 升级就是决定, 不是方法的声誉.
门标准
按顺序完成这些工作, 并在第一次失败时停止.
-
预期目的已写明. ATP 命名要测量的属性, 性能特征和相关标准, 通过 ICH Q14. 批发肽
-
检测对于报告阈值来说是足够的. 该方法必须适合满足Ph. 欧元. 0.1% 合成肽的报告阈值, 根据 EMA 合成肽指南. 一个 280 对于非芳香族物质，仅纳米方法无法通过此门.
-
特异性由三个 ICH Q2 之一证明(R2) 路线. 无干扰, 与正交程序的比较, 或该程序的基本科学原理; 即使程序不具体，也可以证明选择性 (我Q2(R2)).
-
解决响应因素 对于响应与参考材料不同的任何杂质, 通过 ICH Q2(R2).
-
显示稳定性指示能力 通过强制降解, 通过 ICH Q1A(R2).
-
系统适用性由程序设定, 不是从本章中假设的. 美国药典 <621> 需要证明整个分析系统在分析之前和整个分析过程中都能充分运行, 符合专论或分析程序设定的标准; 统一章节增加了峰对称性要求 0.8 到 1.8 并根据半高峰宽计算分辨率 (美国药典 <621> 系统适用性). 通过系统适用性是必要条件, 不适合目的.
用有压力和加标的样品挑战该方法
强制降解和尖峰是将门检查清单变成证据的原因. AQbD艾塞那肽研究筛选了四个参数 (柱化学, 有机改性剂, 酸性调节剂, 梯度时间), 已检测到并部分解决 19 过程- 和产物相关的杂质峰, 并生成了最终的 MODR 验证色谱图 20 峰值在积分面积 0.05% 或更大, USP 分辨率的优化目标至少为 1.5 对于大多数已识别的产品相关杂质 (AQbD 艾塞那肽方法开发研究). 那些 20 峰是检测到的峰, 不限制, 和之间的差距 19 在筛选和 20 验证的价值在于挑战该方法而不是信任它. Kaiser 肽测试
当优化足够时, 以及你到底改变了什么
当合理的变化能够满足分析目标概况时进行优化. 参数变化可以改变选择性以及保留和效率. 当所得证据仍然不足时，添加正交程序或重新设计方法.
改变什么, 为了
为实际关键对选择结构化优化计划. 流动相, 固定相, 梯度和温度相互作用; 一项供应商比较并未建立强制性的变更顺序或通用梯度斜率.
当您需要正交技术或特定化合物的方法开发时
当方法无法分离所有肽相关杂质时，需要采用正交技术, 其中 EMA 合成肽指南 预计可能需要额外的独立方法，并且共洗脱杂质属于 1.0% 除非有正当理由，否则资格门槛. 这不是理论上的规定. 相同的艾塞那肽研究显示了脱酰胺对，其中 RPLC 需要浅层 0.5% 每分钟有机梯度超过 114 分钟仅获得部分分辨率（峰值前沿）, BEH Amide HILIC 即使在 150 毫米, 和 BEH HILIC 在 1% 每分钟有机物 45 分钟, 分析时间减半，通量同时增加一倍 100 毫米柱长 (沃特世艾塞那肽的 RPLC/HILIC 正交分析研究).
选择正交模式
选择遵循主模式看不到的内容. HILIC 是反相无法基线解析的变体的记录补充, HILIC 中的模式很重要: BEH Amide 和 BEH HILIC 在同一脱酰胺对上表现不同. 质量检测是身份识别和共洗脱物种的补充, 因为质量检测器可以读取位于主紫外峰下方的杂质的特征质量位移. 质量检测的局限性是 HRMS 本身无法区分异构体和同量异位杂质, 因为外消旋作用产生与母体药物质量相同的D-氨基酸杂质, TFA 用作离子对剂抑制质谱仪中肽的电离 (LCGC 关于 GLP-1 分析挑战的采访). 共享相同盲点的正交方法不是正交的.
当特定化合物的开发是诚实的答案时
当平台参数和正交模式的任何组合都无法满足 ATP 的要求而无需围绕分析物重新设计方法时，化合物特异性开发是诚实的答案. 证据表明整个班级都是这样: Thermo Fisher 研究得出的结论是，方法优化必须针对化合物特定，并且通用平台方法不能直接应用于不同的 GLP-1 受体激动剂, 根据每种分析物定制色谱条件 (Thermo Fisher 针对索马鲁肽和替泽帕肽的 RPLC-UV 优化研究). 监管框架通过 ICH Q14 适应这一点, 这允许最小的 (传统的) 方法或增强方法的要素, 采用增强方法，利用先验知识和风险评估来识别有影响的参数，并通过单变量或多变量研究建立 MODR (我Q14). 平台知识是起点; ATP 决定它能走多远.
传输和记录包必须携带什么，以便可比性声明能够通过审查
肽的方法转移在小分子转移耐受的细节上失败. 系统停留体积的差异是常见的, 由于肽分离依赖于非常浅的梯度，导致转移失败的原因未被充分认识, 柱温和流速对于肽比对于小分子更重要，因为大分子扩散更慢 (LCGC从业者关于GLP-1方法转移的讨论). 浅梯度放大了仪器之间的体积差异.
该记录必须让独立审查员重建每个实验室所做的事情. 这意味着方法标识和版本; 色谱柱制造商, 化学, 方面, 颗粒和孔径, 序列号或批号, 条件反射史, 注射次数, 储存和更换标准; 仪器和检测器 ID 以及软件和固件版本; 使用测量方法和所应用的任何补偿测量或合格的停留体积; 柱温箱和自动进样器设定点以及实际记录的温度和平衡时间; 和流动相制备详细信息，包括溶剂和试剂等级, 供应商和批号, 水源, pH及调节试剂, 准备日期和时间, 准备者和验证者, 过滤和脱气, 储存容器和有效期或保存时间 (FDA 的可比性和方法转移期望).
数据完整性层
只有当基础数据符合美国铝业协会 (ALCOA) 的预期时，这一记录才站得住脚。. MHRA 将 ALCOA 定义为可归属的, 清晰易读, 同时期的, 原创且准确, 加号表示完整, 持续的, 持久且可用, 并指出原始数据必须允许对活动进行全面重建，并且数据是在动态状态下捕获并以电子方式生成的, 纸质副本不能被视为原始数据 (MHRA 对色谱原始数据的 ALCOA 期望). 对于色谱法来说，这是特定的: 打印的色谱图失去了重新处理数据和扩展基线的能力, 当出现共洗脱问题时，这正是审稿人所需要的能力.
连接的数据包有帮助的地方
交接时的实际失败不是缺少文档，而是缺少文档之间的连接. 当方法版本, 柱地段, 驻留体积测量和积分决策位于单独的文件中, 审查者在不询问原始实验室的情况下无法重建运行, 并且可比性主张在对应性而不是科学上停滞不前. 保存方法记录的连接数据包, 仪器记录和原始色谱数据链接到相同的样品和运行标识符，从而消除了重建步骤. 这就是狭隘, 这样的包在这里发挥实际作用: 它使得审稿人无需一轮提问就可以重建.
将方法问题变成归档问题的常见错误
第一个错误是将系统适用性视为对目的的适用性. 美国药典 <621> 需要完整的分析系统才能充分执行, 按照程序设定的标准, 并且它没有强加通用的分辨率值 (美国药典 <621> 系统适用性). 通过适宜性表明系统今天表现良好, 并不是该方法回答了预期的问题.
第二种是读取紫外线纯度值作为身份或完整性声明. 解析的峰不是已识别的峰, 和一个 98% 面积百分比并不能证明剩余的 2% 是良性的. 第三种假设已解析的峰是单一物种: 观察到的共洗脱杂质为一个峰，取 1.0% 除非另有说明，否则资格门槛 (EMA 合成肽指南). 第四是假设成功的内部转移意味着该方法是可转移的, 当驻留体积和浅梯度改变仪器之间的选择性时 (LCGC从业者关于GLP-1方法转移的讨论).
常见问题解答
通过系统适用性是否意味着平台方法适合目的?
不. 美国药典 <621> 需要证明整个分析系统在分析之前和整个分析过程中都能充分运行, 并且它没有设置通用的分辨率值; 标准来自专着或分析程序 (美国药典 <621> 系统适用性). 适合目的是一个单独的问题, 根据 ICH Q14 中定义的分析目标概况进行回答 (我Q14).
紫外线面积百分比可以作为释放规格的纯度值吗?
它可以作为纯度衡量标准, 但不是一个不合格的人. 面积归一化假设每摩尔的响应相当, 和我 Q2(R2) 指示在分析物响应与参考材料不同的情况下计算相对响应因子 (我Q2(R2)). 检测波长还决定哪些物种进入计算, 自从 280 nm主要检测Trp, 酪氨酸和苯丙氨酸 (沃特世肽方法开发入门读物).
我如何知道是优化还是正交?
当问题是参数范围且关键对对流动相响应时进行优化, 柱化学, 温度或梯度斜率. 当配对不响应其中任何一个时，进行正交, 与艾塞那肽脯氨酸插入变体一样，RPLC 在广泛优化后无法进行基线解析，而 HILIC 达到了 Rs = 2.94 (沃特世艾塞那肽的 RPLC/HILIC 正交分析研究).
是什么导致实验室之间的肽方法转移失败?
停留体积差异是一个常见但未被充分认识的原因, 因为肽分离依赖于非常浅的梯度, 与小分子相比，柱温和流速对肽更重要 (LCGC从业者关于GLP-1方法转移的讨论). 因此，传输记录必须包含测量的停留体积和测量方法, 连同柱地块, 调节历史和流动相制备详细信息 (FDA 的可比性和方法转移期望).
结论
该决定取决于按正确顺序提出的一个问题: 预期目的需要什么, 平台方法是否满足? 先写分析目标概况, 通过 ICH Q14, 然后根据 EMA 测试该方法 0.1% 报告门槛, ICH Q2(R2) 展示特异性的途径, 和稳定性指示能力的强制降解证据. 如果该方法清除了这些门, 按原样使用并记录限制. 如果在参数范围内失败, 按重要顺序进行优化: 流动相, 柱化学, 温度, 然后梯度斜率. 如果选择性失败, 添加不共享相同盲点的正交模式. 如果不围绕分析物重建方法就无法满足 ATP, 致力于特定化合物的开发, 这就是班级级证据所支持的.
转移包是由其他人测试决策的地方. 进行停留体积测量, 色谱柱批次和调节历史, 流动相制备记录和原始电子数据, 因为 MHRA 的重建要求是审查者将适用的. 下一步是获取您面前序列的 ATP，并根据六个门标准运行它; 如果您想要第二双眼睛来了解该评估, 在该方法提交申请之前与专家交谈.
