Phương pháp HPLC nền tảng để phân tích tạp chất GLP-1 thực sự đo lường được những gì - và nó không làm được gì
Nền gradient pha đảo phân tách các peptide chủ yếu bằng tính kỵ nước tổng thể và bề mặt không phân cực có thể tiếp cận được, không phải bằng nhận dạng trình tự, do đó, một chất thay thế dư lượng hoặc đồng phân vị trí có thể thay đổi đáng kể hoạt tính sinh học trong khi tạo ra sự thay đổi lưu giữ nhỏ hơn so với độ biến thiên mở rộng cực đại hoặc hấp phụ (Sơn lót phát triển phương pháp peptide của Waters). Phương pháp này đo lường lượng vật liệu chứa peptit được rửa giải trong một cửa sổ. Cái mà nó không đo được là vật liệu đó thuộc phân tử nào.
Phát hiện kết hợp giới hạn. Phát hiện tại 214 nm phản ứng với các liên kết amide xương sống peptide và do đó về cơ bản đối với tất cả các loài có chứa peptide bao gồm các biến thể trình tự và đoạn cắt ngắn, với phản ứng ít phụ thuộc vào hàm lượng chất thơm hơn 280 bước sóng; 280 nm chủ yếu phát hiện Trp, Tyr và Phe và có thể đại diện cho các tạp chất thiếu chúng (Sơn lót phát triển phương pháp peptide của Waters). MỘT 280 Do đó, phương pháp chỉ có bước sóng mang lại điểm mù phát hiện mà 214 phương pháp nm không.
Bốn tuyên bố rằng một phương pháp peptide được yêu cầu thực hiện
độ tinh khiết, danh tính, nội dung và tính ổn định là bốn tuyên bố riêng biệt, và một kết quả diện tích pic sắc ký không được xác nhận không xác định được cả bốn. Độ tinh khiết là thước đo tương đối về diện tích tích hợp thuộc về đỉnh chính, và bản thân nó không nói gì về danh tính: một mẫu có thể đọc 99% tinh khiết bằng HPLC và vẫn là phân tử sai. Bản sắc được thiết lập bởi đại chúng, lập bản đồ peptit, phân tích axit amin hoặc NMR, và Hướng dẫn về peptide tổng hợp của EMA khuyến nghị ít nhất hai phương pháp trực giao để nhận dạng khi phát hành, với người nộp đơn chịu trách nhiệm hiển thị sự kết hợp xác nhận rõ ràng trình tự.
Nội dung là số lượng peptide hiện diện, thường được biểu thị theo tiêu chuẩn tham chiếu và được hiệu chỉnh theo ion phản, nước và muối. Tính ổn định là một đặc tính của phương pháp cũng như phân tử: Tôi Q1A(R2) yêu cầu nghiên cứu độ ổn định để sử dụng các quy trình đánh giá độ ổn định đã được thẩm định và kiểm tra các thuộc tính dễ bị thay đổi trong quá trình bảo quản, với thử nghiệm căng thẳng xác định các sản phẩm và con đường thoái hóa (Tôi Q1A(R2)). Một phương pháp tinh khiết chưa bao giờ được chứng minh là có thể giải quyết được các loài phân hủy cưỡng bức không phải là phương pháp chỉ ra sự ổn định, bất kể kết quả phù hợp với hệ thống của nó nói gì.
Tại sao các peptide GLP-1 có cấu trúc tương tự nhau và các tạp chất của chúng lại đánh bại gradient pha đảo chung
Sự tương đồng về cấu trúc giữa các peptide GLP-1 không nhất thiết dẫn đến đặc tính sắc ký tương tự, đó là lý do tại sao một phương pháp nền tảng có thể yêu cầu tối ưu hóa theo từng hợp chất cụ thể (Lập luận của Thermo Fisher rằng sự tương đồng về cấu trúc không dự đoán được đặc tính sắc ký). Nguồn tương tự báo cáo rằng thành phần pha động có ảnh hưởng lớn hơn đến việc tách tạp chất so với hóa học pha tĩnh, và các pha động chứa TFA thường cho hình dạng và độ phân giải pic tốt hơn so với axit formic.
Hóa học cột thay đổi câu trả lời ngay cả khi độ dốc không. Trên một phương thức và độ dốc duy nhất, CORTECS Premier C18+ và ACQUITY Premier Peptide CSH C18 đã phân lập được các biến thể liraglutide độc đáo nhất, trong khi CORTECS Premier C18+ và ACQUITY Premier CSH Phenyl-Hexyl đã phân lập được các biến thể semaglutide độc đáo nhất; Peptide CSH C18 tách liraglutide tốt hơn semaglutide và cột Phenyl-Hexyl làm điều ngược lại (So sánh lựa chọn cột của Waters cho liraglutide và semaglutide). Không có cột nào tốt nhất, chỉ là cột tốt nhất cho chất phân tích được đặt tên.
Các lớp tạp chất làm mất tính chọn lọc
Các loại tạp chất khác nhau ở mức độ chúng thay đổi phân tử và liệu sự thay đổi đó có thể nhìn thấy được đối với gradient pha đảo hay không. Sự thay đổi khối lượng bên dưới đến từ tài liệu thử nghiệm peptide của bên thứ ba và mô tả tính chất hóa học, không phải là giới hạn bổ sung.
|
Lớp tạp chất |
Sự dịch chuyển khối lượng |
Tại sao các cuộc đấu tranh giai đoạn đảo ngược |
|---|---|---|
|
quá trình oxy hóa (Đã gặp, Trp, Cys) |
+16 Và |
Thay đổi cực nhỏ; thường rửa giải gần hoặc dưới cha mẹ |
|
Oxy hóa kép |
+32 Và |
Sự kiện oxy hóa thứ hai, sự thay đổi duy trì tích lũy |
|
Khử amit (Asn→Asp, Gln→Glu) |
Khớp nối Hobt +1 Và |
Gần đẳng áp với cha mẹ; trường hợp đồng rửa giải cổ điển |
|
Chu kỳ đầu cuối N (Gln→pyroGlu) |
-17 Có |
Nhà cung cấp peptit Việc mất đầu N tích điện sẽ làm thay đổi khả năng lưu giữ một cách tinh vi |
|
Xóa Của peptide sự liên tiếp |
Phụ thuộc vào dư lượng còn thiếu và sửa đổi |
Thiếu dư lượng; có thể kỵ nước nhiều hoặc ít hơn bố mẹ |
|
Nhóm bảo vệ dư lượng (tBu, pbf, Trt) |
Tính toán nhóm giữ lại ròng từ công thức phân tử của nó |
Thẻ kỵ nước từ sự bảo vệ không hoàn toàn |
Tính chọn lọc không phải là chế độ thất bại duy nhất. Phương pháp HPLC peptide cũng thất bại do hấp phụ và liên kết không đặc hiệu với silica, silanol dư, bề mặt kim loại, khoai tây chiên, ống, lọ và bộ lọc; thông qua sự kết tụ và kết tủa được điều khiển bởi pH, cường độ ion, nhiệt độ, dung môi, nồng độ hoặc đóng băng-tan băng; thông qua các tương tác pha tĩnh thứ cấp tạo ra chất đuôi, chia tách hoặc không rửa giải; thông qua sự hấp phụ qua trung gian kim loại, đặc biệt là Asp- và các loài chứa Glu; thông qua hiệu ứng chuyển tiếp và bộ nhớ; và thông qua sự xuống cấp trên cột (việc xem xét các dạng lỗi HPLC peptide). Một phương pháp có thể vượt qua mọi kiểm tra độ chọn lọc và vẫn làm mất chất phân tích vào hệ thống.
Nhiệt độ và pha động không phải là đòn bẩy một chiều
Tăng nhiệt độ cột là cách khắc phục phản xạ, và nó không đáng tin cậy. Tăng nhiệt độ cột từ 30 ° C đến 60 °C đã phân giải hai tạp chất tirzepatide cùng rửa giải ở nhiệt độ thấp hơn, nhưng trên semaglutide với cột Hypersil GOLD C4 và pha động chứa TFA, cùng nhiệt độ tăng làm giảm độ phân giải và đồng rửa giải hai tạp chất (Nghiên cứu tối ưu hóa RPLC-UV của Thermo Fisher cho semaglutide và tirzepatide). Hướng của hiệu ứng phụ thuộc vào sự kết hợp cột và pha động, không theo quy luật chung.
Nghiên cứu về nhiệt độ của Waters cho thấy hành vi không đơn điệu tương tự trong một phương pháp: sự thay đổi nhiệt độ cột ±5 °C tạo ra sự khác biệt về độ chọn lọc ảnh hưởng đến độ phân giải của các loại tạp chất đối với liraglutide, tirzepatide và semaglutide, với độ phân giải tốt nhất giữa một cặp quan trọng (đỉnh cao 9 Và 10) Tại 55 °C và hai loài đó cùng rửa giải ở 65 °C (Một Tổng hợp Hobt Nghiên cứu về nước về sự phụ thuộc nhiệt độ trong quá trình phân tách GLP-1). Sự thay đổi năm độ đã chuyển một cặp quan trọng từ trạng thái phân giải sang trạng thái đồng rửa giải, đó là biên độ chuyển giao giữa các phòng thí nghiệm phải tồn tại.
Nơi phần trăm diện tích UV không còn là con số có độ tinh khiết có thể bảo vệ được
Chuẩn hóa diện tích là thước đo độ tinh khiết hoạt động. Việc chuyển đổi nó thành phần khối lượng hoặc phần mol đòi hỏi các giả định về hệ số đáp ứng thích hợp, phạm vi phát hiện và tích hợp. Thành phần dư lượng hoặc nhãn khác nhau có thể phản ứng khác nhau, và các loài không được phát hiện hoặc cùng rửa giải cần được đánh giá thêm.
Bước sóng phát hiện quyết định tạp chất nào được đưa vào phép tính. Bởi vì 280 nm chủ yếu phát hiện Trp, Tyr và Phe, tạp chất thiếu những dư lượng đó có thể được thể hiện dưới mức hoặc không nhìn thấy được ở bước sóng đó, trong khi 214 nm phản ứng về cơ bản với tất cả các loài có chứa peptide (Sơn lót phát triển phương pháp peptide của Waters). Đọc theo yêu cầu của EMA rằng các phương pháp phù hợp với 0.1% ngưỡng báo cáo, Một 280 Phương pháp chỉ có bước sóng mang lại khoảng trống phát hiện đối với các tạp chất không liên quan đến peptit thơm mà hướng dẫn này không loại trừ.
Hậu quả của quá trình đồng rửa giải
Hướng dẫn của EMA đề cập đến các tạp chất được quan sát cùng nhau dưới dạng một đỉnh và có thể cần có các phương pháp độc lập. Áp dụng đánh giá trình độ chuyên môn liên quan cho mức độ kết hợp được đo lường; không giải thích 1.0% ngưỡng dưới dạng quyền bỏ qua danh tính cá nhân hoặc dưới dạng thay đổi trong ngưỡng báo cáo.
Trường hợp thực tế được ghi lại rõ ràng. Một peptit có thể đọc 98% tinh khiết bằng HPLC trong khi +16 Đỉnh vệ tinh Đà, đồng rửa giải oxy hóa một phần với pic chính, vẫn vô hình với tia cực tím và có thể nhìn thấy rõ ràng bởi khối lượng. Nghiên cứu LC-UV/MS trên exenatide chịu ứng suất nhiệt đã tìm thấy bảy pic có diện tích pic tăng đáng kể, với máy dò khối chỉ định một +16 Sự chênh lệch oxy hóa Da ở độ lệch thời gian lưu −1,3 phút và đoạn phân cắt không có enzyme ở 3,254.1 Và (Hồ sơ tạp chất LC-UV/MS của exenatide bị căng thẳng). Chỉ riêng dấu vết UV đã báo cáo một con số tinh khiết mà dữ liệu khối lượng mâu thuẫn.
Cách xác định phương pháp nền tảng phù hợp với mục đích cho một trình tự mới trước khi bạn dựa vào nó
Trình độ chuyên môn bắt đầu từ mục đích đã định, không phải từ phương pháp. ICH Q14 định nghĩa hồ sơ mục tiêu phân tích là một bản tóm tắt tiềm năng về các đặc tính hiệu suất mô tả mục đích dự định và tiêu chí hiệu suất dự đoán của phép đo phân tích, và tuyên bố rằng ATP thúc đẩy việc lựa chọn công nghệ phân tích và được duy trì trong suốt vòng đời để đảm bảo quy trình vẫn phù hợp với mục đích đã định (Hồ sơ mục tiêu phân tích của ICH Q14). Viết ATP cho chuỗi mới trước, sau đó kiểm tra phương pháp nền tảng chống lại nó.
Kỳ vọng bằng chứng ba tầng xuất phát từ đó. Sàng lọc và mô tả đặc tính chấp nhận tính linh hoạt và dữ liệu chắc chắn không đầy đủ nếu các hạn chế được ghi lại; thử nghiệm lâm sàng hoặc phát triển sớm đòi hỏi trình độ chuyên môn với việc chuẩn bị mẫu xác định, tính đặc hiệu thích hợp, độ chính xác và độ chính xác sơ bộ, phạm vi sử dụng được và sự phù hợp cơ bản của hệ thống; giải phóng, kiểm tra độ ổn định và hỗ trợ nộp hồ sơ yêu cầu tiêu chí chấp nhận được xác định trước, hiệu suất được xác nhận hoặc đủ điều kiện, sự mạnh mẽ của các nhà phân tích, ngày và thiết bị, các tiêu chuẩn và bằng chứng tham chiếu được kiểm soát phương pháp này chỉ ra độ ổn định khi cần thiết (Chiến lược kiểm soát phân tích thích hợp theo từng giai đoạn). Cấp bậc của bạn đặt ra bằng chứng, và việc thăng hạng là quyết định, không phải danh tiếng của phương pháp.
Tiêu chí cổng
Làm việc thông qua những điều này theo thứ tự, và dừng lại ở lần thất bại đầu tiên.
-
Mục đích dự định được viết. ATP đặt tên cho các thuộc tính cần đo, các đặc tính hiệu suất và các tiêu chí liên quan, thông qua ICH Q14. Bán buôn peptide
-
Phát hiện đủ cho ngưỡng báo cáo. Phương pháp phải phù hợp để đáp ứng Ph. Euro. 0.1% ngưỡng báo cáo cho peptide tổng hợp, theo Hướng dẫn về peptide tổng hợp của EMA. MỘT 280 phương pháp chỉ bước sóng không thành công cổng này đối với các loài không thơm.
-
Tính đặc hiệu được thể hiện bằng một trong ba ICH Q2(R2) tuyến đường. Không có sự can thiệp, so sánh với một thủ tục trực giao, hoặc các nguyên tắc khoa học cơ bản của quy trình; Tính chọn lọc có thể được chứng minh ngay cả khi quy trình không cụ thể (Tôi quý 2(R2)).
-
Các yếu tố phản ứng được giải quyết đối với bất kỳ tạp chất nào có phản ứng khác với vật liệu tham chiếu, qua ICH Q2(R2).
-
Khả năng chỉ báo độ ổn định được thể hiện thông qua sự xuống cấp bắt buộc, thông qua ICH Q1A(R2).
-
Sự phù hợp của hệ thống được thiết lập bởi quy trình, không được giả định từ chương. USP <621> yêu cầu chứng minh rằng hệ thống phân tích hoàn chỉnh hoạt động đầy đủ trước và trong suốt quá trình phân tích., với các tiêu chí được quy định bởi chuyên khảo hoặc quy trình phân tích; chương hài hòa bổ sung thêm yêu cầu đối xứng đỉnh cao của 0.8 ĐẾN 1.8 và tính toán độ phân giải từ chiều rộng cực đại ở một nửa chiều cao (USP <621> sự phù hợp của hệ thống). Đạt được sự phù hợp của hệ thống là điều kiện cần, không phù hợp với mục đích.
Thử thách phương pháp với các mẫu bị căng thẳng và có thêm mẫu
Sự xuống cấp và tăng vọt cưỡng bức là những gì biến danh sách kiểm tra cổng thành bằng chứng. Nghiên cứu exenatide AQbD đã sàng lọc bốn thông số (cột hóa học, chất biến tính hữu cơ, chất điều chỉnh tính axit, thời gian dốc), được phát hiện và giải quyết một phần 19 quá trình- và đỉnh tạp chất liên quan đến sản phẩm, và tạo ra sắc ký xác minh MODR cuối cùng với 20 đỉnh tại khu vực tích hợp của 0.05% hoặc cao hơn, chống lại mục tiêu tối ưu hóa độ phân giải USP ít nhất 1.5 đối với phần lớn các tạp chất liên quan đến sản phẩm được xác định (nghiên cứu phát triển phương pháp exenatide AQbD). Những thứ kia 20 đỉnh được phát hiện đỉnh, không giới hạn, và khoảng cách giữa 19 lúc sàng lọc và 20 lúc xác minh là giá trị của việc thách thức phương pháp hơn là tin tưởng vào nó. Thử nghiệm Kaiser cho peptide
Khi tối ưu hóa là đủ, và chính xác thì bạn thay đổi điều gì
Tối ưu hóa khi những thay đổi hợp lý có thể đáp ứng hồ sơ mục tiêu phân tích. Thay đổi thông số có thể làm thay đổi độ chọn lọc cũng như khả năng lưu giữ và hiệu quả. Thêm một quy trình trực giao hoặc thiết kế lại phương pháp khi bằng chứng thu được vẫn chưa đầy đủ.
Những gì cần thay đổi, theo thứ tự
Chọn kế hoạch tối ưu hóa có cấu trúc cho các cặp quan trọng thực tế. Pha động, pha tĩnh, gradient và nhiệt độ tương tác; một so sánh nhà cung cấp không thiết lập thứ tự thay đổi bắt buộc hoặc độ dốc chung.
Khi bạn cần các kỹ thuật trực giao hoặc phát triển phương pháp phức hợp cụ thể
Kỹ thuật trực giao là cần thiết khi phương pháp không thể tách được tất cả các tạp chất liên quan đến peptide, cái đó Hướng dẫn về peptide tổng hợp của EMA dự đoán bằng cách tuyên bố rằng có thể cần các phương pháp độc lập bổ sung và các tạp chất đồng rửa giải thuộc phạm vi điều chỉnh của 1.0% ngưỡng trình độ chuyên môn trừ khi được chứng minh. Đây không phải là một điều khoản mang tính lý thuyết. Nghiên cứu exenatide tương tự cho thấy một cặp khử amit trong đó RPLC cần một vùng nông 0.5% độ dốc hữu cơ mỗi phút trên 114 phút chỉ cho độ phân giải một phần với mặt trước đỉnh, BEH Amide HILIC đồng rửa giải chúng ngay cả ở 150 mm, và BEH HILIC đạt được độ phân giải một phần ở 1% hữu cơ mỗi phút trong 45 phút, giảm một nửa thời gian phân tích và tăng gấp đôi thông lượng cùng một lúc 100 chiều dài cột mm (Nghiên cứu hồ sơ trực giao RPLC/HILIC của Waters về exenatide).
Chọn chế độ trực giao
Sự lựa chọn tuân theo những gì chế độ chính không thể nhìn thấy. HILIC là phần bổ sung được ghi lại cho các biến thể có pha đảo ngược không thể giải quyết được đường cơ sở, và chế độ quan trọng trong HILIC: BEH Amide và BEH HILIC hoạt động khác nhau trên cùng một cặp khử amit. Phát hiện khối lượng là sự bổ sung cho việc nhận dạng và cho các loài cùng rửa giải, vì máy dò khối có thể đọc được sự dịch chuyển khối lượng đặc trưng của tạp chất nằm dưới đỉnh UV chính. Giới hạn của việc phát hiện khối lượng là HRMS tự nó không thể phân biệt được tạp chất đồng phân và tạp chất đẳng áp, bởi vì quá trình phân biệt chủng tộc tạo ra tạp chất axit D-amino có cùng khối lượng với thuốc gốc, và TFA được sử dụng làm tác nhân ghép ion ngăn chặn quá trình ion hóa peptide trong máy quang phổ khối (cuộc phỏng vấn LCGC về những thách thức phân tích GLP-1). Một phương pháp trực giao có chung điểm mù thì không trực giao.
Khi sự phát triển dành riêng cho hợp chất là câu trả lời trung thực
Sự phát triển dành riêng cho hợp chất là câu trả lời trung thực khi ATP không thể được đáp ứng bằng bất kỳ sự kết hợp nào giữa các tham số nền tảng và chế độ trực giao mà không thiết kế lại phương pháp xung quanh chất phân tích. Bằng chứng chỉ ra điều đó cho cả lớp: nghiên cứu của Thermo Fisher kết luận rằng việc tối ưu hóa phương pháp phải dành riêng cho từng hợp chất và phương pháp nền tảng phổ quát không thể được áp dụng trực tiếp cho các chất chủ vận thụ thể GLP-1 khác nhau, với điều kiện sắc ký phù hợp với từng chất phân tích (Nghiên cứu tối ưu hóa RPLC-UV của Thermo Fisher cho semaglutide và tirzepatide). Khung pháp lý điều chỉnh điều này thông qua ICH Q14, cho phép tối thiểu (truyền thống) cách tiếp cận hoặc các yếu tố của một cách tiếp cận nâng cao, với cách tiếp cận nâng cao sử dụng kiến thức trước đó và đánh giá rủi ro để xác định các thông số có ảnh hưởng và thiết lập MODR thông qua các nghiên cứu đơn biến hoặc đa biến (Tôi Q14). Kiến thức nền tảng là điểm khởi đầu; ATP quyết định nó có thể đi được bao xa.
Gói chuyển giao và hồ sơ phải mang theo những gì để yêu cầu có khả năng so sánh được xem xét
Phương pháp chuyển giao peptide không thành công trên các chi tiết mà quá trình chuyển phân tử nhỏ có thể chấp nhận được. Sự khác biệt về khối lượng lưu trú của hệ thống là điều thường xuyên xảy ra, nguồn thất bại trong chuyển giao bị đánh giá thấp vì sự phân tách peptit phụ thuộc vào độ dốc rất nông, và nhiệt độ cột cũng như tốc độ dòng có ảnh hưởng lớn hơn đối với peptide so với các phân tử nhỏ vì các phân tử lớn khuếch tán chậm hơn (Cuộc thảo luận của học viên LCGC về việc chuyển giao phương pháp GLP-1). Độ dốc nông khuếch đại mọi chênh lệch âm lượng giữa các nhạc cụ.
Hồ sơ phải để một người đánh giá độc lập xây dựng lại những gì mỗi phòng thí nghiệm đã làm. Điều đó có nghĩa là nhận dạng và phiên bản phương thức; nhà sản xuất cột, hoá học, kích thước, kích thước hạt và lỗ chân lông, số sê-ri hoặc số lô, lịch sử điều hòa, số lần tiêm, tiêu chí lưu trữ và thay thế; ID thiết bị và máy dò với các phiên bản phần mềm và chương trình cơ sở; thể tích dừng được đo hoặc xác định bằng phương pháp đo và bất kỳ khoản bù nào được áp dụng; điểm đặt lò cột và bộ lấy mẫu tự động với nhiệt độ và thời gian cân bằng được ghi thực tế; và các chi tiết chuẩn bị pha động bao gồm các loại dung môi và thuốc thử, nhà cung cấp và số lô, nguồn nước, thuốc thử pH và điều chỉnh, ngày giờ chuẩn bị, người chuẩn bị và người xác minh, lọc và khử khí, thùng chứa và thời gian hết hạn hoặc lưu giữ (Khả năng so sánh và kỳ vọng chuyển giao phương pháp của FDA).
Lớp toàn vẹn dữ liệu
Hồ sơ chỉ có thể được bảo vệ nếu dữ liệu cơ bản đáp ứng mong đợi của ALCOA. MHRA định nghĩa ALCOA là có thể quy cho, dễ đọc, đương thời, nguyên bản và chính xác, với dấu cộng đề cập đến hoàn thành, nhất quán, bền bỉ và sẵn có, và tuyên bố rằng dữ liệu thô phải cho phép tái cấu trúc toàn bộ các hoạt động và dữ liệu được ghi lại ở trạng thái động và được tạo bằng điện tử, bản sao giấy không thể được coi là dữ liệu thô (Kỳ vọng ALCOA của MHRA đối với dữ liệu sắc ký thô). Đối với sắc ký, điều này là cụ thể: sắc ký đồ được in sẽ mất khả năng xử lý lại dữ liệu và mở rộng đường cơ sở, đó chính xác là khả năng mà người đánh giá cần có khi nảy sinh câu hỏi đồng rửa giải.
Trường hợp gói dữ liệu được kết nối sẽ giúp ích
Thất bại thực tế khi bàn giao không phải là thiếu tài liệu mà là thiếu kết nối giữa các tài liệu. Khi phiên bản phương thức, lô cột, phép đo khối lượng lưu trú và các quyết định tích hợp nằm trong các tệp riêng biệt, người đánh giá không thể xây dựng lại quá trình chạy mà không hỏi phòng thí nghiệm ban đầu, và tuyên bố về khả năng so sánh dừng lại ở sự tương ứng hơn là khoa học. Gói dữ liệu được kết nối giúp lưu giữ bản ghi phương thức, bản ghi thiết bị và dữ liệu sắc ký thô được liên kết với cùng một mã định danh mẫu và lần chạy sẽ loại bỏ bước tái thiết đó. Đó là cái hẹp, vai trò thực tế của một gói như vậy ở đây: nó giúp người đánh giá có thể tái cấu trúc mà không cần phải trả lời một loạt câu hỏi.
Những lỗi thường gặp biến câu hỏi phương pháp thành câu hỏi nộp hồ sơ
Sai lầm đầu tiên là coi sự phù hợp của hệ thống là sự phù hợp với mục đích. USP <621> đòi hỏi hệ thống phân tích hoàn chỉnh để thực hiện đầy đủ, với các tiêu chí do quy trình đặt ra, và nó không áp đặt giá trị độ phân giải chung (USP <621> sự phù hợp của hệ thống). Việc vượt qua sự phù hợp cho biết hệ thống đang hoạt động ngày hôm nay, không phải là phương pháp trả lời câu hỏi dự định.
Thứ hai là đọc số độ tinh khiết UV dưới dạng nhận dạng hoặc yêu cầu về tính đầy đủ. Đỉnh được giải quyết không phải là đỉnh được xác định, và một 98% phần trăm diện tích không phải là bằng chứng cho thấy phần còn lại 2% là lành tính. Thứ ba là giả sử đỉnh được giải quyết là một loài duy nhất: tạp chất đồng rửa giải được quan sát thấy là một đỉnh lấy 1.0% ngưỡng trình độ chuyên môn trừ khi có lý do khác (Hướng dẫn về peptide tổng hợp của EMA). Thứ tư là giả sử chuyển khoản nội bộ thành công có nghĩa là phương thức này có thể chuyển nhượng được, khi âm lượng dừng và độ dốc nông sẽ di chuyển độ chọn lọc giữa các dụng cụ (Cuộc thảo luận của học viên LCGC về việc chuyển giao phương pháp GLP-1).
Câu hỏi thường gặp
Việc vượt qua sự phù hợp của hệ thống có nghĩa là phương pháp nền tảng phù hợp với mục đích?
KHÔNG. USP <621> yêu cầu chứng minh rằng hệ thống phân tích hoàn chỉnh hoạt động đầy đủ trước và trong suốt quá trình phân tích., và nó không đặt giá trị độ phân giải phổ quát; tiêu chí đến từ chuyên khảo hoặc quy trình phân tích (USP <621> sự phù hợp của hệ thống). Phù hợp với mục đích là một câu hỏi riêng biệt, được trả lời dựa trên hồ sơ mục tiêu phân tích được xác định trong ICH Q14 (Tôi Q14).
Phần trăm diện tích UV có thể đóng vai trò là số độ tinh khiết cho thông số phát hành không?
Nó có thể phục vụ như một thước đo độ tinh khiết, nhưng không phải là một người không đủ tiêu chuẩn. Chuẩn hóa diện tích giả định phản ứng tương đương trên mỗi nốt ruồi, và tôi Q2(R2) chỉ đạo rằng các hệ số phản ứng tương đối được tính toán trong đó phản ứng của chất phân tích khác với vật liệu tham chiếu (Tôi quý 2(R2)). Bước sóng phát hiện cũng đặt ra loài nào được đưa vào tính toán, từ 280 nm chủ yếu phát hiện Trp, Tyr và Phe (Sơn lót phát triển phương pháp peptide của Waters).
Làm cách nào để biết nên tối ưu hóa hay chuyển sang trực giao?
Tối ưu hóa khi vấn đề nằm ở phạm vi tham số và cặp quan trọng phản hồi với pha động, cột hóa học, độ dốc nhiệt độ hoặc độ dốc. Trực giao khi cặp không phản hồi với bất kỳ điều nào trong số đó, như với biến thể chèn proline exenatide mà RPLC không thể giải quyết cơ bản sau khi tối ưu hóa rộng rãi trong khi HILIC đạt Rs = 2.94 (Nghiên cứu hồ sơ trực giao RPLC/HILIC của Waters về exenatide).
Điều gì làm cho việc chuyển giao phương pháp peptide giữa các phòng thí nghiệm không thành công?
Sự khác biệt về khối lượng lưu trú là nguyên nhân thường xuyên và bị đánh giá thấp, bởi vì sự phân tách peptit phụ thuộc vào độ dốc rất nông, nhiệt độ cột và tốc độ dòng chảy quan trọng hơn đối với peptide so với các phân tử nhỏ (Cuộc thảo luận của học viên LCGC về việc chuyển giao phương pháp GLP-1). Do đó, hồ sơ chuyển giao phải ghi thể tích dừng đo được và phương pháp đo, cùng với lô cột, lịch sử điều hòa và chi tiết chuẩn bị pha động (Khả năng so sánh và kỳ vọng chuyển giao phương pháp của FDA).
Phần kết luận
Quyết định phụ thuộc vào một câu hỏi được hỏi theo đúng thứ tự: mục đích dự định yêu cầu những gì, và phương pháp nền tảng có đáp ứng được nó không? Viết hồ sơ mục tiêu phân tích trước, thông qua ICH Q14, sau đó kiểm tra phương pháp với EMA 0.1% ngưỡng báo cáo, ICH Q2(R2) các con đường để chứng minh tính đặc hiệu, và bằng chứng xuống cấp cưỡng bức về khả năng chỉ ra sự ổn định. Nếu phương thức xóa các cổng đó, sử dụng nguyên trạng và ghi lại những hạn chế. Nếu nó không thành công trong phạm vi tham số, tối ưu hóa theo thứ tự quan trọng: pha động, cột hóa học, nhiệt độ, sau đó độ dốc độ dốc. Nếu nó thất bại về tính chọn lọc, thêm chế độ trực giao không có chung điểm mù. Nếu không thể đáp ứng ATP nếu không xây dựng lại phương pháp xung quanh chất phân tích, cam kết phát triển theo từng hợp chất cụ thể, đó là những gì bằng chứng cấp lớp hỗ trợ.
Gói chuyển nhượng là nơi quyết định được người khác kiểm tra. Tiến hành đo thể tích dừng, lô cột và lịch sử điều hòa, bản ghi chuẩn bị pha động và dữ liệu điện tử thô, vì yêu cầu tái thiết của MHRA là yêu cầu mà người đánh giá sẽ áp dụng. Bước tiếp theo là lấy ATP cho chuỗi trước mặt bạn và chạy nó theo tiêu chí sáu cổng; nếu bạn muốn có đôi mắt thứ hai về đánh giá đó, nói chuyện với một chuyên gia trước khi phương pháp được đưa vào hồ sơ.
