Что на самом деле измеряет платформенный метод ВЭЖХ для анализа примесей GLP-1, а что нет?
Градиент обращенной фазы платформы разделяет пептиды главным образом по общей гидрофобности и доступной неполярной поверхности., не по идентичности последовательности, таким образом, замена одного остатка или позиционный изомер могут существенно изменить биологическую активность, вызывая при этом изменение удерживания меньше, чем уширение пика или изменчивость адсорбции. (Учебник по разработке пептидного метода Уотерса). Этот метод измеряет, сколько пептидсодержащего материала элюируется в окне.. Что он не измеряет, так это то, какой молекулой является этот материал..
Обнаружение расширяет границы. Обнаружение на 214 нм реагирует на амидные связи пептидного остова и, следовательно, практически на все виды, содержащие пептиды, включая варианты последовательностей и укороченные варианты., с откликом, гораздо менее зависящим от содержания ароматических веществ, чем 280 нм; 280 нм в основном обнаруживает Trp, Tyr и Phe и могут недооценивать примеси, в которых их нет. (Учебник по разработке пептидного метода Уотерса). А 280 Таким образом, метод, основанный только на нм, несет в себе «слепую зону» обнаружения, которую 214 нм метод не.
Четыре утверждения, что пептидный метод должен быть реализован
Чистота, личность, содержание и стабильность — это четыре отдельные претензии, и один неподтвержденный результат хроматографического определения площади пика не позволяет установить все четыре. Чистота — это относительная мера того, какая часть интегрированной площади принадлежит основному пику., и это ничего не говорит об идентичности само по себе: образец можно прочитать 99% чистый по данным ВЭЖХ, но все равно это не та молекула. Личность устанавливается массовым путем, пептидное картирование, аминокислотный анализ или ЯМР, и Рекомендации EMA по синтетическим пептидам рекомендует как минимум два ортогональных метода для идентификации при выпуске, при этом заявитель несет ответственность за показ комбинации, однозначно подтверждает последовательность.
Содержание – это количество присутствующего пептида., обычно выражается относительно эталонного стандарта и корректируется на противоионы, вода и соль. Стабильность — это такое же свойство метода, как и молекулы.: Я Q1A(Р2) требует проведения исследований стабильности с использованием проверенных процедур определения стабильности и изучения свойств, которые могут измениться во время хранения., со стресс-тестированием для выявления продуктов и путей разложения (Я Q1A(Р2)). Метод чистоты, который никогда не устранял частицы, подвергающиеся принудительному разложению, не является методом определения стабильности., что бы ни говорил его результат пригодности системы.
Почему структурно схожие пептиды GLP-1 и их примеси противодействуют обычному обращенно-фазовому градиенту
Структурное сходство пептидов GLP-1 не обязательно приводит к схожему хроматографическому поведению., поэтому метод платформы может потребовать оптимизации для конкретного соединения. (Аргумент Термо Фишера о том, что структурное сходство не предсказывает хроматографическое поведение.). Тот же источник сообщает, что состав подвижной фазы оказал большее влияние на отделение примесей, чем химия неподвижной фазы., и что подвижные фазы, содержащие ТФУ, часто дают лучшую форму и разрешение пиков, чем муравьиная кислота..
Химический анализ колонки меняет ответ, даже если градиент не меняется.. Об одном методе и градиенте, CORTECS Premier C18+ и ACQUITY Premier Peptide CSH C18 выделили самые уникальные варианты лираглутида., в то время как CORTECS Premier C18+ и ACQUITY Premier CSH Phenyl-Hexyl выделили самые уникальные варианты семаглутида.; Пептид CSH C18 отделял лираглутид лучше, чем семаглутид, а колонка с фенил-гексилом делала обратное. (Сравнение выбора колонок Уотерса для лираглутида и семаглутида). Не существует одной лучшей колонки, только лучшая колонка для названного аналита.
Классы примесей, которые нарушают селективность
Классы примесей различаются по тому, насколько они меняют молекулу и видно ли это изменение в градиенте обращенной фазы.. Приведенные ниже изменения массы взяты из стороннего документа по тестированию пептидов и описывают химический состав., не компендиальный предел.
|
Класс примесей |
Массовый сдвиг |
Почему обратная фаза борется |
|---|---|---|
|
Окисление (Встретились, Трп, Цис) |
+16 И |
Небольшое изменение полярности; часто элюируется близко к родительскому элементу или под ним |
|
Двойное окисление |
+32 И |
Второе событие окисления, совокупный сдвиг удержания |
|
Деамидирование (Асн→Асп, Глн→Глу) |
Хобт Муфта +1 И |
Почти изобарно с родительским; классический случай коэлюции |
|
N-концевая циклизация (Глн→пироГлу) |
-17 Да |
Поставщики пептидов Потеря заряженного N-конца слегка меняет ретенцию. |
|
Удаление О пептидах последовательность |
Зависит от недостающего остатка и модификации |
Отсутствует остаток; может быть более или менее гидрофобным, чем исходный |
|
Остаточная защитная группа (tBu, Пбф, Трт) |
Рассчитайте чистую удерживаемую группу по ее молекулярной формуле. |
Гидрофобная метка от неполного снятия защиты |
Селективность — не единственный вид отказа. Методы пептидной ВЭЖХ также терпят неудачу из-за адсорбции и неспецифического связывания с диоксидом кремния., остаточные силанолы, металлические поверхности, фритты, трубки, флаконы и фильтры; за счет агрегации и осаждения, обусловленного pH, ионная сила, температура, растворитель, концентрация или замораживание-оттаивание; за счет вторичных взаимодействий в стационарной фазе, приводящих к образованию хвостов, расщепление или неэлюирование; за счет металлоопосредованной адсорбции, особенно Asp- и глюсодержащие виды; за счет эффектов переноса и памяти; и за счет деградации на колонке (обзор режимов неудач пептидной ВЭЖХ). Метод может пройти любую проверку селективности и при этом потерять аналит в системе..
Температура и подвижная фаза не являются рычагами одностороннего действия.
Повышение температуры колонки — рефлекторное решение, и это не надежно. Повышение температуры колонки от 30 °С до 60 °C разделил две примеси тирзепатида, которые элюировались совместно при более низкой температуре., но на семаглутиде с колонкой Hypersil GOLD C4 и подвижными фазами, содержащими TFA, такое же повышение температуры привело к снижению разрешения и одновременному элюированию двух примесей. (Исследование Thermo Fisher по оптимизации RPLC-УФ для семаглутида и тирзепатида). Направление эффекта зависит от комбинации колонки и подвижной фазы., не по общему правилу.
Исследование температуры Уотерса показывает такое же немонотонное поведение в рамках одного метода.: Изменения температуры колонки на ±5 °C приводили к различиям в селективности, которые влияли на разрешение видов примесей для лираглутида., тирзепатид и семаглутид, с лучшим разрешением между одной критической парой (пики 9 и 10) в 55 °C, и эти два вида совместно элюируются при 65 °С (а Хобт Синтез Исследование Уотерса температурной зависимости при разделении GLP-1). Изменение на пять градусов переместило критическую пару из решенной в совместно элюируемую., какой запас должен выдержать перевод между лабораториями.
Где процент площади УФ-излучения перестает быть оправданным показателем чистоты
Нормализация площади является мерой эксплуатационной чистоты.. Преобразование его в массовую или молярную долю требует соответствующих допущений относительно коэффициента отклика., охват обнаружения и интеграция. Различные составы остатков или метки могут реагировать по-разному., и необнаруженные или совместно элюируемые виды требуют дальнейшей оценки..
Длина волны обнаружения определяет, какие примеси вообще учитываются в расчете.. Потому что 280 нм в основном обнаруживает Trp, Тир и Фе, примесь, в которой отсутствуют эти остатки, может быть недостаточно представлена или невидима на этой длине волны, пока 214 нм реагирует практически на все виды, содержащие пептиды (Учебник по разработке пептидного метода Уотерса). Прочтите требования EMA о том, что методы должны быть пригодны для 0.1% порог отчетности, а 280 Метод, основанный только на нм, имеет пробел в обнаружении примесей, связанных с неароматическим пептидом, что не оправдывается руководством..
Последствия совместного элюирования
В рекомендациях EMA рассматриваются примеси, наблюдаемые вместе в виде одного пика, а также возможная потребность в независимых методах.. Применить соответствующую квалификационную оценку к измеренному комбинированному уровню; не интерпретируйте 1.0% пороговое значение как разрешение игнорировать отдельные личности или как изменение порогового значения отчетности..
Практический пример хорошо документирован. Пептид может читать 98% чистый с помощью ВЭЖХ, в то время как +16 Пик спутника, частичное окисление, элюируемое совместно с основным пиком, остается невидимым для УФ и хорошо видимым по массе. Исследование ЖХ-УФ/МС эксенатида, подвергшегося термическому воздействию, выявило семь пиков со значительно увеличенной площадью пика., с масс-детектором, назначающим +16 Разница в окислении Da при сдвиге времени удерживания на -1,3 мин и фрагменте неферментативного расщепления при 3,254.1 И (Анализ профиля примесей эксенатида, подвергшегося стрессу, методом ЖХ-УФ/МС). Только УФ-след мог бы указать показатель чистоты, которому противоречат данные о массе..
Как квалифицировать метод платформы как подходящий для новой последовательности, прежде чем полагаться на него
Квалификация начинается с намеченной цели, не из метода. ICH Q14 определяет аналитический целевой профиль как предполагаемое резюме характеристик производительности, описывающих предполагаемую цель и ожидаемые критерии эффективности аналитического измерения., и заявляет, что ATP определяет выбор аналитической технологии и поддерживается на протяжении всего жизненного цикла, чтобы гарантировать, что процедура остается пригодной для намеченной цели. (Аналитический целевой профиль ICH Q14). Сначала напишите ATP для новой последовательности., затем протестируйте метод платформы на его основе.
Трехуровневое ожидание доказательств следует из этого.. Скрининг и характеристика допускают гибкость и неполные данные о надежности, если зафиксированы ограничения.; ранние клинические или опытно-конструкторские испытания требуют квалификации с определенной подготовкой проб, соответствующая специфика, предварительная точность и аккуратность, полезный диапазон и базовая пригодность системы; выпускать, тестирование стабильности и поддержки подачи заявок требует заранее определенных критериев приемки, подтвержденная или квалифицированная производительность, надежность среди аналитиков, дни и оборудование, контролируемые эталонные стандарты и доказательства стабильности метода, указывающие, где это необходимо. (стратегия аналитического контроля, соответствующая фазе). Уровень, на котором вы находитесь, устанавливает доказательства, и переход на более высокий уровень — это решение, не репутация метода.
Критерии ворот
Проработайте их по порядку, и остановиться при первой же неудаче.
-
Целевое назначение написано. ATP называет атрибуты, подлежащие измерению., эксплуатационные характеристики и связанные с ними критерии, через ICH Q14. Пептиды оптом
-
Обнаружение соответствует порогу отчетности. Метод должен соответствовать Ph.. Евро. 0.1% порог отчетности для синтетических пептидов, согласно Рекомендации EMA по синтетическим пептидам. А 280 Метод, использующий только нм, не подходит для неароматических соединений..
-
Специфичность демонстрирует один из трех ICH Q2.(Р2) маршруты. Отсутствие помех, сравнение с ортогональной процедурой, или основные научные принципы процедуры; селективность может быть продемонстрирована, даже если процедура неспецифична (я Q2(Р2)).
-
Факторы реагирования рассматриваются для любых примесей, реакция которых отличается от реакции эталонного материала, через ICH Q2(Р2).
-
Показана возможность индикации устойчивости через вынужденную деградацию, через ICH Q1A(Р2).
-
Пригодность системы устанавливается процедурой, не предполагается из главы. USP <621> требует демонстрации того, что вся аналитическая система работает адекватно до и на протяжении всего анализа., с критериями, установленными фармакопейной статьей или аналитической методикой; гармонизированная глава добавляет требование пиковой симметрии 0.8 к 1.8 и вычисляет разрешение по ширине пика на половине высоты (USP <621> пригодность системы). Прохождение пригодности системы является необходимым условием, не соответствует поставленной цели.
Усложнение метода с использованием напряженных и шипованных образцов
Принудительная деградация и скачки превращают контрольный список ворот в доказательства. В исследовании эксенатида AQbD оценивались четыре параметра. (колонка химии, органический модификатор, кислотный модификатор, время градиента), обнаружен и частично решен 19 процесс- и пики примесей, связанные с продуктом, и подготовил окончательную проверочную хроматограмму MODR с 20 пики в интегрированной области 0.05% или больше, против цели оптимизации разрешения Фармакопеи США не менее 1.5 для большинства выявленных примесей, связанных с продуктом (исследование по разработке метода эксенатида AQbD). Те 20 пики обнаруживаются пики, не ограничивает, и разрыв между 19 на скрининге и 20 при проверке — это ценность того, чтобы бросить вызов методу, а не доверять ему.. Тест Кайзера на пептиды
Когда оптимизации достаточно, и что именно ты меняешь
Оптимизируйте, когда правдоподобные изменения могут соответствовать аналитическому целевому профилю. Изменения параметров могут изменить селективность, а также удержание и эффективность.. Добавьте ортогональную процедуру или перепроектируйте метод, если полученные доказательства остаются неадекватными..
Что изменить, чтобы
Выберите структурированный план оптимизации для фактических критических пар.. Подвижная фаза, стационарная фаза, Градиент и температура взаимодействуют; одно сравнение поставщиков не устанавливает обязательного порядка изменений или универсального градиента наклона.
Когда вам нужны ортогональные методы или разработка методов для конкретных соединений
Ортогональные методы необходимы, когда метод не может отделить все примеси, связанные с пептидами., который Рекомендации EMA по синтетическим пептидам предвидит, заявляя, что могут потребоваться дополнительные независимые методы и что совместно элюируемые примеси подпадают под действие 1.0% квалификационный порог, если не обосновано. Это не теоретическое положение. В том же исследовании эксенатида показано, что в паре дезамидирования RPLC требовалось неглубокое вмешательство. 0.5% органический поминутный градиент более 114 минут только для частичного разрешения с фронтом пика, BEH Amide HILIC совместно элюировал их даже при 150 мм, и BEH HILIC добились частичного разрешения 1% органических в минуту в 45 минуты, вдвое сокращая время анализа и одновременно удваивая производительность 100 мм длина колонки (Исследование ортогонального профилирования эксенатида, проведенное Уотерсом RPLC/HILIC).
Выбор ортогонального режима
Выбор следует из того, что не видит основной режим. HILIC является документально подтвержденным дополнением для вариантов, которые не могут быть разрешены в обращенной фазе., и режим имеет значение в HILIC: BEH Amide и BEH HILIC вели себя по-разному в одной и той же паре дезамидирования.. Массовое обнаружение является дополнением для идентификации и совместного элюирования видов., поскольку масс-детектор может считывать характерный сдвиг массы примеси, которая остается ниже основного УФ-пика. Ограничением массового обнаружения является то, что HRMS сам по себе не может различать изомерные и изобарные примеси., поскольку в результате рацемизации образуются примеси D-аминокислот той же массы, что и исходное лекарственное средство., а TFA, используемый в качестве агента, связывающего ионы, подавляет ионизацию пептидов в масс-спектрометре. (интервью LCGC об аналитических задачах GLP-1). Ортогональный метод, который имеет одно и то же слепое пятно, не является ортогональным..
Когда разработка конкретных соединений является честным ответом
Разработка, специфичная для соединения, является честным ответом, когда АТФ не может быть достигнута с помощью какой-либо комбинации параметров платформы и ортогональных режимов без перепроектирования метода с учетом аналита.. Факты указывают на это для класса в целом.: Исследование Thermo Fisher пришло к выводу, что оптимизация метода должна быть специфичной для каждого соединения и что метод универсальной платформы не может быть напрямую применен к различным агонистам рецептора GLP-1., с хроматографическими условиями, адаптированными для каждого аналита (Исследование Thermo Fisher по оптимизации RPLC-УФ для семаглутида и тирзепатида). Нормативно-правовая база учитывает это посредством ICH Q14., что позволяет минимально (традиционный) подход или элементы расширенного подхода, с расширенным подходом, использующим предварительные знания и оценку риска для определения влиятельных параметров и установления MODR посредством одномерных или многомерных исследований. (Я Q14). Знание платформы — отправная точка; ATP решает, как далеко оно зайдет.
Что должен содержать пакет передачи и записей, чтобы заявление о сопоставимости выдержало проверку
Передача метода для пептидов не удалась из-за деталей, которые переносятся при переносе малых молекул.. Различия в объеме пребывания в системе являются частой проблемой., недооцененный источник неудачного переноса, поскольку разделение пептидов основано на очень мелких градиентах, температура колонки и скорость потока более важны для пептидов, чем для малых молекул, поскольку крупные молекулы диффундируют медленнее. (Обсуждение практикующими специалистами LCGC переноса метода GLP-1). Мелкий градиент усиливает каждую разницу в громкости между инструментами..
Запись должна позволить независимому рецензенту восстановить то, что делала каждая лаборатория.. Это означает идентификатор и версию метода.; производитель колонн, химия, размеры, размер частиц и пор, серийный номер или номер партии, история кондиционирования, количество инъекций, критерии хранения и замены; идентификаторы приборов и детекторов с указанием версий программного обеспечения и прошивки; измеренный или квалифицированный объем задержки с указанием метода измерения и любой примененной компенсации; заданные значения термостата колонки и автосамплера с фактическими зарегистрированными температурами и временем уравновешивания; и сведения о приготовлении подвижной фазы, включая классы растворителей и реагентов., поставщик и номера партий, источник воды, Реагент для регулирования pH и регулирования, дата и время приготовления, составитель и проверяющий, фильтрация и дегазация, контейнер для хранения и срок годности или время хранения (Ожидания FDA по сопоставимости и передаче методов).
Уровень целостности данных
Этот рекорд можно защитить только в том случае, если лежащие в его основе данные соответствуют ожиданиям ALCOA.. MHRA определяет ALCOA как принадлежащую, разборчивый, современный, оригинально и точно, с плюсом, обозначающим завершение, последовательный, стойкий и доступный, и заявляет, что необработанные данные должны позволять полную реконструкцию деятельности и что данные были собраны в динамическом состоянии и сгенерированы в электронном виде., бумажные копии не могут считаться необработанными данными (Ожидания MHRA от ALCOA в отношении необработанных хроматографических данных). Для хроматографии это специфично: распечатанная хроматограмма теряет возможность повторной обработки данных и расширения базовой линии, это именно та способность, которая нужна рецензенту, когда возникает вопрос о совместном элюировании..
Где помогает подключенный пакет данных
Практическая ошибка при передаче – это не отсутствие документа, а отсутствие связи между документами.. Когда версия метода, партия колонн, измерение объема задержки и решения по интеграции хранятся в отдельных файлах, рецензент не может реконструировать анализ, не обратившись в лабораторию, отправившую его, и требование сопоставимости застревает в переписке, а не в науке.. Подключенный пакет данных, в котором хранится запись метода., запись прибора и необработанные хроматографические данные, связанные с одними и теми же идентификаторами пробы и серии, устраняют этот этап реконструкции. Это узкий, практическую роль здесь играет такой пакет: это делает возможной реконструкцию рецензента без вопросов.
Распространенные ошибки, которые превращают вопрос о методе в вопрос о подаче заявки
Первая ошибка — рассматривать пригодность системы как пригодность для использования по назначению.. USP <621> требует, чтобы вся аналитическая система работала адекватно, с критериями, установленными процедурой, и он не навязывает универсальное значение разрешения (USP <621> пригодность системы). Прохождение пригодности говорит о том, что система ведет себя сегодня, не то чтобы метод отвечал на поставленный вопрос.
Второй — это считывание номера чистоты УФ-излучения как удостоверения личности или заявления о полноте.. Разрешенный пик не является идентифицированным пиком., и 98% процент площади не является свидетельством того, что оставшиеся 2% доброкачественный. Третий предполагает, что разрешенный пик относится к одному виду.: совместно элюирующиеся примеси наблюдаются в виде одного пика, занимающего 1.0% квалификационный порог, если не обосновано иное (Рекомендации EMA по синтетическим пептидам). В-четвертых, предполагается, что успешный внутренний перенос означает, что метод можно передавать., когда объем задержки и небольшие градиенты меняют селективность между инструментами (Обсуждение практикующими специалистами LCGC переноса метода GLP-1).
Часто задаваемые вопросы
Означает ли прохождение пригодности системы, что метод платформы соответствует поставленной цели??
Нет. USP <621> требует демонстрации того, что вся аналитическая система работает адекватно до и на протяжении всего анализа., и он не устанавливает универсального значения разрешения; критерии взяты из монографии или аналитической процедуры (USP <621> пригодность системы). Соответствие целям - отдельный вопрос, ответили в соответствии с аналитическим целевым профилем, определенным в ICH Q14 (Я Q14).
Может ли процент площади УФ-излучения служить показателем чистоты для спецификации выпуска??
Это может служить мерой чистоты., но не как неквалифицированный. Нормализация площади предполагает сопоставимый ответ на моль., и я Q2(Р2) предписывает рассчитывать относительные коэффициенты чувствительности, если реакция аналита отличается от реакции эталонного материала (я Q2(Р2)). Длина волны обнаружения также определяет, какие виды входят в расчет., с 280 нм в основном обнаруживает Trp, Тир и Фе (Учебник по разработке пептидного метода Уотерса).
Как узнать, оптимизировать или идти ортогонально??
Оптимизируйте, когда проблема заключается в диапазоне параметров и критическая пара реагирует на подвижную фазу., колонка химии, температура или наклон градиента. Идите ортогонально, когда пара не отвечает ни на один из этих, как и в случае с вариантом эксенатида с вставкой пролина, RPLC не смог разрешить исходный уровень после обширной оптимизации, в то время как HILIC достиг Rs = 2.94 (Исследование ортогонального профилирования эксенатида, проведенное Уотерсом RPLC/HILIC).
Что делает перенос пептидного метода неудачным между лабораториями?
Разница в объеме задержки — частая и недооцененная причина., поскольку разделение пептидов основано на очень мелких градиентах, температура колонки и скорость потока имеют большее значение для пептидов, чем для малых молекул. (Обсуждение практикующими специалистами LCGC переноса метода GLP-1). Поэтому в протоколе передачи должны быть указаны измеренный объем выдержки и метод измерения., вместе с партией колонн, история кондиционирования и подробности подготовки подвижной фазы (Ожидания FDA по сопоставимости и передаче методов).
Заключение
Решение сводится к одному вопросу, заданному в правильном порядке.: что требует целевое назначение, и соответствует ли ему метод платформы? Сначала напишите аналитический целевой профиль, через ICH Q14, затем проверьте метод на соответствие EMA 0.1% порог отчетности, ICH Q2(Р2) способы демонстрации специфичности, и свидетельство принудительной деградации о способности индикации стабильности. Если метод очищает эти ворота, используйте его как есть и запишите ограничения. Если это не удается в диапазоне параметров, оптимизируйте в том порядке, который имеет значение: подвижная фаза, колонка химии, температура, затем градиентный уклон. Если он не работает по селективности, добавить ортогональную моду, которая не имеет одной и той же слепой зоны. Если АТФ невозможно достичь без перестройки метода вокруг аналита, взять на себя обязательство по разработке конкретных соединений, это то, что подтверждают доказательства на уровне класса.
В трансферном пакете решение проверяется кем-то другим.. Выполните измерение объема задержки, партия колонн и история кондиционирования, запись приготовления подвижной фазы и необработанные электронные данные, потому что рецензент будет применять требования MHRA к реконструкции. Следующий шаг — взять ATP для последовательности перед вами и сравнить ее с шестью критериями ворот.; если вам нужна вторая пара глаз на эту оценку, поговорите с экспертом, прежде чем метод попадет в заявку.
