Брз одговор
You already have a platform reversed-phase gradient that carries your screening and trending work. The question is whether it can also carry a release, compara…
Што всушност мери методот HPLC на платформа за анализа на нечистотии GLP-1 - а што не
Градиент со обратна фаза на платформа ги одвојува пептидите главно со целокупната хидрофобност и пристапната неполарна површина, не според идентитетот на низата, така што една супституција на остаток или позиционен изомер може значително да ја промени биолошката активност притоа создавајќи промена на задржување помала од варијабилноста на врвното проширување или адсорпција (Вотерс пептиден метод-развој на прајмер). Она што го мери методот е колку материјал што содржи пептид елуира во прозорецот. Она што не го мери е која молекула е тој материјал.
Детекцијата ја зголемува границата. Откривање на 214 nm реагира на амидните врски на пептидниот столб и затоа суштински на сите видови што содржат пептиди, вклучувајќи варијанти на секвенца и скратувања, со одговор многу помалку зависен од ароматична содржина отколку 280 nm; 280 nm главно детектира Trp, Tyr и Phe и може недоволно да ги претставуваат нечистотиите на кои им недостасуваат (Вотерс пептиден метод-развој на прајмер). А 280 Затоа, методот само nm носи слепа точка за откривање што a 214 nm методот не.
Четирите тврдат дека се бара да се спроведе методот на пептид
Чистота, идентитет, содржината и стабилноста се четири посебни тврдења, и еден невалиден резултат на хроматографската врвна површина не ги утврдува сите четири. Чистотата е релативна мерка за тоа колку од интегрираната површина припаѓа на главниот врв, и самото не кажува ништо за идентитетот: примерок може да се прочита 99% чиста со HPLC и сепак е погрешна молекула. Идентитетот се утврдува по маса, мапирање на пептиди, анализа на аминокиселини или NMR, и на Упатство за синтетички пептиди на ЕМА препорачува најмалку два ортогонални методи за идентификација при ослободување, со барателот одговорен за прикажување на комбинацијата недвосмислено ја потврдува низата.
Содржината е количината на присутен пептид, нормално изразен во однос на референтниот стандард и коригиран за контра-јон, вода и сол. Стабилноста е својство на методот исто колку и молекулата: Јас Q1A(R2) бара студии за стабилност за да се користат потврдени процедури што укажуваат на стабилност и да се испитаат атрибутите подложни на промена за време на складирањето, со стрес-тестирање со кои се идентификуваат продуктите и патеките на деградација (Јас Q1A(R2)). Методот на чистота за кој никогаш не се покажало дека разрешува видови со принудна деградација не е метод што укажува на стабилност, што и да кажува резултатот за соодветноста на системот.
Зошто структурно сличните GLP-1 пептиди и нивните нечистотии го поразуваат генеричкиот градиент на обратна фаза
Структурната сличност меѓу GLP-1 пептидите не мора да значи слично хроматографско однесување, поради што методот на платформа може да бара оптимизација специфична за соединението (Аргументот на Термо Фишер дека структурната сличност не го предвидува хроматографското однесување). Истиот извор известува дека составот на мобилната фаза има поголемо влијание врз одвојувањето на нечистотијата од стационарната фаза хемија, и дека мобилните фази кои содржат TFA често даваат подобра форма и резолуција на врвот од мравја киселина.
Хемијата на колоните го менува одговорот дури и кога градиентот не го менува. На еден метод и градиент, CORTECS Premier C18+ и ACQUITY Premier Peptide CSH C18 ги изолираа најуникатните варијанти на лираглутид, додека CORTECS Premier C18+ и ACQUITY Premier CSH Phenyl-Hexyl ги изолираа најуникатните варијанти на семаглутид; Пептидот CSH C18 го одвои лираглутидот подобро од семаглутидот, а колоната фенил-хексил го направи обратното (Споредба за избор на колона на Waters за лираглутид и семаглутид). Не постои единствена најдобра колумна, само најдобра колона за именуван аналит.
Класите на нечистотии кои ја поразуваат селективноста
Класите на нечистотии се разликуваат по тоа колку ја менуваат молекулата и по тоа дали таа промена е видлива за градиент со обратна фаза. Масовните поместувања подолу доаѓаат од документ за тестирање на пептиди од трета страна и ја опишуваат хемијата, не е дополнителна граница.
|
Класа на нечистотија |
Масовна смена |
Зошто се бори обратната фаза |
|---|---|---|
|
Оксидација (Мет, Трп, Cys) |
+16 И |
Мала промена на поларитетот; често елуира блиску или под родителот |
|
Двојна оксидација |
+32 И |
Втор настан на оксидација, кумулативна смена на задржување |
|
Деамидација (Asn→Asp, Gln→Glu) |
Хобт спојка +1 И |
Речиси изобаричен со родител; класичниот случај на ко-елуција |
|
N-терминална цикализација (Gln→pyroGlu) |
-17 Да |
Добавувачи на пептиди Губењето на наполнетиот N-крајник суптилно го менува задржувањето |
|
Бришење На пептиди низа |
Зависи од исчезнатиот остаток и модификација |
Недостасува остаток; може да биде повеќе или помалку хидрофобна од матичната |
|
Резидуална заштитна група (tBu, Pbf, Трт) |
Пресметајте ја нето задржаната група од нејзината молекуларна формула |
Хидрофобна ознака од нецелосна дезаштита |
Селективноста не е единствениот начин на неуспех. Пептидните HPLC методи исто така не успеваат преку адсорпција и неспецифично врзување за силициум диоксид, резидуални силиноли, метални површини, фрит, цевки, вијали и филтри; преку агрегација и врнежи поттикнати од рН, јонска јачина, температура, растворувач, концентрација или замрзнување-одмрзнување; преку секундарни стационарни-фазни интеракции кои произведуваат јаловина, разделување или неелуција; преку метално посредувана адсорпција особено на Asp- и видови кои содржат Глу; преку пренос и мемориски ефекти; и преку деградација на колона (преглед на начини на неуспех на пептид HPLC). Еден метод може да ја помине секоја проверка на селективност и сепак да изгуби аналит во системот.
Температурата и мобилната фаза не се еднонасочни лостови
Подигнувањето на температурата на колоната е рефлексен фикс, и не е доверлив. Зголемување на температурата на колоната од 30 °C до 60 °C разреши две нечистотии од тирзепатид кои се ко-елутираа на пониска температура, но на семаглутид со колона Hypersil GOLD C4 и мобилни фази кои содржат TFA истата температура ја зголемува резолуцијата и ја намалува резолуцијата и ко-елутира две нечистотии (Термо Фишер RPLC-UV оптимизациска студија за семаглутид и тирзепатид). Насоката на ефектот зависи од комбинацијата на колоната и мобилната фаза, не по општо правило.
Студијата за температурата на Вотерс го покажува истото немонотоно однесување во еден метод: температурните промени на колоната од ± 5 °C создадоа разлики во селективноста што влијаеше на резолуцијата на видовите нечистотии за лираглутид, тирзепатид и семаглутид, со најдобра резолуција помеѓу еден критичен пар (врвови 9 и 10) на 55 °C и тие два вида кои ко-елуираат на 65 °C (а Синтеза на Хобт Водите ја проучуваат зависноста од температурата во сепарациите на GLP-1). Промената од пет степени го премести критичниот пар од решен во ко-елуирање, што е маргина што треба да преживее преносот помеѓу лабораториите.
Онаму каде што процентот на УВ површина престанува да биде одбранбен број за чистота
Нормализацијата на површината е мерка за оперативна чистота. Конвертирањето во масена или моларна фракција бара соодветни претпоставки за факторот на одговор, покриеност со откривање и интеграција. Различни состави или етикети на остатоци може да реагираат различно, а неоткриените или ко-елутирачките видови бараат дополнителна проценка.
Детекциската бранова должина одлучува кои нечистотии воопшто влегуваат во пресметката. Бидејќи 280 nm главно детектира Trp, Тир и Фе, нечистотијата на која и недостасуваат тие остатоци може да биде недоволно претставена или невидлива на таа бранова должина, додека 214 nm реагира на суштински сите видови кои содржат пептиди (Вотерс пептиден метод-развој на прајмер). Прочитајте против барањето EMA дека методите се соодветни за 0.1% праг на известување, а 280 Методот само nm носи празнина за откривање на неароматични нечистотии поврзани со пептиди што упатството не го оправдува.
Последица на ко-елуција
Упатството за ЕМА се однесува на нечистотиите забележани заедно како еден врв и можната потреба од независни методи. Применете ја релевантната проценка на квалификациите на измереното комбинирано ниво; не го толкувајте 1.0% праг како дозвола за превидување на индивидуалните идентитети или како промена на прагот за известување.
Практичниот случај е добро документиран. Пептидот може да чита 98% чисто со HPLC додека а +16 Да сателитски врв, делумна оксидација ко-елуирање со главниот врв, останува невидлив за УВ и јасно видлив по маса. Работата LC-UV/MS на термички напреганиот егзенатид откри седум врвови со значително покачена површина на врвовите, при што детекторот за маса доделува a +16 Da оксидациска разлика при промена на времето на задржување од -1,3 мин и фрагмент на неензимско расцепување на 3,254.1 И (LC-UV/MS профилирање на нечистотии на напрегнат егзенатид). УВ трагата сама би пријавила број на чистота што масовните податоци се контрадикторни.
Како да се квалификува методот на платформа како погоден за цел за нова низа пред да се потпрете на него
Квалификацијата започнува од намената, не од методот. ICH Q14 го дефинира аналитичкиот целен профил како проспективно резиме на карактеристиките на изведбата што ја опишува намената и очекуваните критериуми за изведба на аналитичкото мерење, и наведува дека АТП го придвижува изборот на аналитичка технологија и се одржува во текот на животниот циклус за да се осигура дека постапката останува погодна за намената (Аналитички целен профил на ICH Q14). Прво напишете го ATP за новата низа, потоа тестирајте го методот на платформа против него.
Од тоа произлегува тристепеното очекување докази. Скринингот и карактеризацијата толерираат податоци за флексибилност и нецелосни робусност доколку се евидентираат ограничувања; рано клиничко или развојно тестирање бара квалификација со дефинирана подготовка на примерокот, соодветна специфичност, прелиминарна прецизност и точност, употреблив опсег и основна соодветност на системот; ослободување, стабилноста и тестирањето што го поддржува поднесувањето бараат претходно дефинирани критериуми за прифаќање, потврдена или квалификувана изведба, робусност кај аналитичарите, денови и опрема, контролирани референтни стандарди и докази дека методот покажува стабилност каде што е потребно (стратегијата за аналитичка контрола која одговара на фазата). Нивото во кое се наоѓате ги поставува доказите, и поместувањето на ниво е одлуката, не репутацијата на методот.
Критериумите на портата
Работете низ овие по редослед, и застанете на првиот неуспех.
-
Наведената цел е напишана. АТП ги именува атрибутите што треба да се измерат, карактеристиките на изведбата и придружните критериуми, преку ICH Q14. Пептиди на големо
-
Откривањето е адекватно за прагот за известување. Методот мора да биде соодветен за исполнување на Ph. евра. 0.1% праг на известување за синтетички пептиди, по Упатство за синтетички пептиди на ЕМА. А 280 Методот само за nm не успева во оваа порта за неароматични видови.
-
Специфичноста се демонстрира со еден од трите ICH Q2(R2) правци. Отсуство на пречки, споредба со ортогонална постапка, или основните научни принципи на постапката; селективноста може да се покаже дури и кога постапката не е специфична (I Q2(R2)).
-
Факторите на одговор се адресирани за секоја нечистотија чиј одговор се разликува од референтниот материјал, преку ICH Q2(R2).
-
Прикажана е способноста што укажува на стабилност преку присилна деградација, преку ICH Q1A(R2).
-
Соодветноста на системот е поставена со процедурата, не се претпоставува од поглавјето. USP <621> бара да се покаже дека целосниот аналитички систем функционира соодветно пред и во текот на анализата, со критериуми поставени со монографијата или аналитичката постапка; усогласеното поглавје додава барање за врвна симетрија на 0.8 до 1.8 и ја пресметува резолуцијата од ширината на врвот на половина висина (USP <621> соодветноста на системот). Соодветноста на системот за полагање е неопходен услов, не е кондиција за целта.
Предизвикување на методот со нагласени и шилести примероци
Присилната деградација и скокот се она што го претвора списокот за проверка на портата во доказ. Студијата AQbD exenatide скринираше четири параметри (колона хемија, органски модификатор, киселински модификатор, време на градиент), откриени и делумно решени 19 процес- и врвовите на нечистотијата поврзани со производот, и произведе финален MODR-верификација хроматограм со 20 врвови на интегрирана област на 0.05% или поголема, против оптимизациска цел на USP резолуција од најмалку 1.5 за поголемиот дел од идентификуваните нечистотии поврзани со производот (студијата за развој на методот AQbD exenatide). Оние 20 врвови се откриени врвови, не ограничувања, и јазот помеѓу 19 на скрининг и 20 при верификацијата е вредноста на предизвикување на методот наместо да му верувате. Кајзер тест за пептиди
Кога оптимизацијата е доволна, и што точно менуваш
Оптимизирајте кога веродостојните промени можат да го задоволат аналитичкиот целен профил. Промените на параметрите може да ја променат селективноста, како и задржувањето и ефикасноста. Додадете ортогонална постапка или редизајнирајте го методот кога добиените докази остануваат несоодветни.
Што да се промени, со цел
Изберете структуриран план за оптимизација за вистинските критични парови. Мобилна фаза, стационарна фаза, градиентот и температурата комуницираат; една споредба на продавачот не воспоставува задолжителен редослед на промени или универзален наклон на градиент.
Кога ви требаат ортогонални техники или развој на метод специфични за соединенија
Потребни се ортогонални техники кога методот не може да ги одвои сите нечистотии поврзани со пептиди, кои на Упатство за синтетички пептиди на ЕМА предвидува наведувајќи дека може да бидат потребни дополнителни независни методи и дека нечистотиите за ко-елуирање спаѓаат во 1.0% квалификациски праг освен ако не е оправдан. Ова не е теоретска одредба. Истата студија на егзенатид покажува пар деамидација каде што на RPLC му треба плитко 0.5% органски во минута градиент над 114 минути за само делумна резолуција со фронтирање на врвот, БЕХ Амиде ХИЛИЌ ги ко-елуирал дури во 150 мм, и БЕХ ХИЛИЌ постигнаа делумна резолуција на 1% органски во минута во 45 минути, преполовување на времето за анализа и удвојување на пропусната моќ истовремено 100 mm должина на колона (Студија за ортогонално профилирање на Waters' RPLC/HILIC на exenatide).
Избор на ортогонален режим
Изборот следи од она што примарниот режим не може да го види. HILIC е документиран комплемент за варијанти кои обратната фаза не може да ги реши основната линија, а режимот е важен во рамките на HILIC: БЕХ Амиде и БЕХ ХИЛИЌ се однесуваа поинаку на ист пар на деамидација. Масовното откривање е додаток за идентитетот и за ко-елутирачките видови, бидејќи масовниот детектор може да го прочита карактеристичното поместување на масата на нечистотијата што останува под главниот врв на УВ. Границата на масовно откривање е дека HRMS не може сам по себе да ги разликува изомерните и изобарните нечистотии, бидејќи со расемизација се добиваат нечистотии од D-аминокиселини со иста маса како и матичниот лек, и TFA што се користи како средство за спарување на јони ја потиснува јонизацијата на пептидите во масениот спектрометар (интервјуто на LCGC за аналитичките предизвици на GLP-1). Ортогонален метод што ја дели истата слепа точка не е ортогонален.
Кога развојот специфичен за соединенија е искрен одговор
Развојот специфичен за соединение е искрен одговор кога ATP не може да се исполни со каква било комбинација на параметри на платформата и ортогонални режими без редизајнирање на методот околу аналитот. Доказите укажуваат на тоа за целото одделение: студијата Thermo Fisher заклучи дека оптимизацијата на методот мора да биде специфична за соединението и дека методот на универзална платформа не може директно да се примени на различни агонисти на рецепторот GLP-1, со хроматографски услови приспособени на секој аналит (Термо Фишер RPLC-UV оптимизациска студија за семаглутид и тирзепатид). Регулаторната рамка го прилагодува ова преку ICH Q14, што овозможува минимална (традиционален) пристап или елементи на засилен пристап, со подобрен пристап користејќи претходно знаење и проценка на ризик за да се идентификуваат влијателните параметри и да се воспостави MODR преку едноваријантни или повеќеваријантни студии (I П14). Познавањето на платформата е почетна точка; АТП одлучува до каде ќе стигне.
Она што мора да го носи пакетот за пренос и евиденција, така што барањето за споредливост може да преживее преглед
Трансферот на методот за пептиди не успева за детали што ги толерираат трансферите на мали молекули. Разликите во волуменот на просторот на системот се чести, недоволно ценет извор на неуспех на трансферот бидејќи пептидните сепарации се потпираат на многу плитки градиенти, а температурата на колоната и брзината на проток се позначајни за пептидите отколку за малите молекули бидејќи големите молекули се дифузираат побавно (Дискусија на практикантот на LCGC за трансфер на методот GLP-1). Плиткиот градиент ја засилува секоја јачина разлика помеѓу инструментите.
Записот треба да дозволи независен рецензент да го реконструира она што го направила секоја лабораторија. Тоа значи идентитет и верзија на методот; производител на колони, хемијата, димензии, големина на честички и пори, сериски или број на лота, историја на условување, број на инјекции, критериуми за складирање и замена; ИД на инструменти и детектори со верзии на софтвер и фирмвер; измерен или квалификуван волумен на просторот со методот на мерење и која било применета компензација; поставки на колона-печка и автосемплер со реални регистрирани температури и време на рамнотежа; и детали за подготовка за мобилна фаза, вклучувајќи оценки за растворувачи и реагенси, добавувач и броеви на лота, извор на вода, pH и реагенс за прилагодување, датум и време на подготовка, подготвувач и проверувач, филтрирање и дегасирање, сад за складирање и време на истекување или задржување (Споредливост на FDA и очекувања за пренос на метод).
Слој за интегритет на податоци
Евиденцијата може да се одбрани само ако основните податоци ги исполнуваат очекувањата на ALCOA. MHRA го дефинира ALCOA како што може да се припише, читлив, истовремена, оригинални и точни, со плус што се однесува на заврши, конзистентна, трајни и достапни, и наведува дека необработените податоци мора да овозможат целосна реконструкција на активностите и дека кога податоците биле заробени во динамична состојба и генерирани електронски, хартиените копии не можат да се сметаат за необработени податоци (Очекувањата на ALCOA на MHRA за хроматографски необработени податоци). За хроматографија ова е специфично: печатениот хроматограм ја губи способноста повторно да ги обработи податоците и да ја прошири основната линија, што е токму способноста што му е потребна на рецензентот кога ќе се појави прашање за ко-елуција.
Каде што помага поврзан пакет со податоци
Практичниот неуспех при предавањето не е документ што недостасува, туку недостасува врска помеѓу документите. Кога верзијата на методот, колоната многу, мерењето на волуменот на престојот и одлуките за интеграција живеат во посебни датотеки, рецензентот не може да го реконструира бегството без да ја праша почетната лабораторија, а барањето за споредливост заглавува на кореспонденцијата, а не на науката. Поврзан пакет со податоци што ја чува евиденцијата на методот, записот на инструментот и необработените хроматографски податоци поврзани со ист примерок и идентификатори за извршување го отстранува тој чекор на реконструкција. Тоа е тесниот, практична улога овде игра таков пакет: ја овозможува реконструкцијата на рецензентот без круг прашања.
Вообичаени грешки кои го претвораат методското прашање во прашање за поднесување
Првата грешка е третирањето на соодветноста на системот како соодветност за целта. USP <621> бара комплетниот аналитички систем да функционира адекватно, со критериуми утврдени со постапката, и не наметнува универзална вредност за резолуција (USP <621> соодветноста на системот). Полагањето соодветност вели дека системот се однесува денес, не дека методот одговара на планираното прашање.
Вториот е читање на УВ број за чистота како идентитет или тврдење за комплетноста. Решен врв не е идентификуван врв, и а 98% површина проценти не е доказ дека останатите 2% е бенигна. Третиот е претпоставката дека решен врв е еден вид: ко-елутирачки нечистотии забележани како еден врв земаат на 1.0% квалификациски праг освен ако поинаку не е оправдано (Упатство за синтетички пептиди на ЕМА). Четвртиот е претпоставката за успешен внатрешен трансфер значи дека методот е пренослив, кога волуменот на задржување и плитките градиенти ја движат селективноста помеѓу инструментите (Дискусија на практикантот на LCGC за трансфер на методот GLP-1).
Најчесто поставувани прашања
Дали положувањето на соодветноста на системот значи дека методот на платформата е погоден за намената?
бр. USP <621> бара да се покаже дека целосниот аналитички систем функционира соодветно пред и во текот на анализата, и не поставува универзална вредност за резолуција; критериумите произлегуваат од монографијата или аналитичката постапка (USP <621> соодветноста на системот). Фитнес за цел е посебно прашање, одговорено наспроти аналитичкиот целен профил дефиниран во ICH Q14 (I П14).
Дали процентот на УВ површина може да послужи како број на чистота за спецификација за ослободување?
Може да послужи како мерка за чистота, но не како неквалификуван. Нормализацијата на областа претпоставува споредлив одговор по мол, и јас Q2(R2) упатува да се пресметаат факторите на релативен одговор кога одговорот на аналитот се разликува од референтниот материјал (I Q2(R2)). Детекциската бранова должина исто така поставува кои видови влегуваат во пресметката, бидејќи 280 nm главно детектира Trp, Тир и Фе (Вотерс пептиден метод-развој на прајмер).
Како да знам дали да оптимизирам или да одам ортогонално?
Оптимизирајте кога проблемот е опсегот на параметрите и критичниот пар реагира на мобилната фаза, колона хемија, температура или наклон на градиент. Одете ортогонално кога парот не одговара на ниту едно од нив, како и со варијантата за вметнување на exenatide пролин која RPLC не можеше да ја реши основната линија по обемна оптимизација додека HILIC достигна Rs = 2.94 (Студија за ортогонално профилирање на Waters' RPLC/HILIC на exenatide).
Што прави да не успее трансферот на пептиден метод помеѓу лабораториите?
Разликите во волуменот на просторот се честа и недоволно ценета причина, бидејќи пептидните сепарации се потпираат на многу плитки градиенти, а температурата на колоната и брзината на проток се повеќе важни за пептидите отколку за малите молекули (Дискусија на практикантот на LCGC за трансфер на методот GLP-1). Затоа, записот за пренос мора да го содржи измерениот волумен на просторот и методот на мерење, заедно со колона многу, историја на климатизација и детали за подготовка на мобилната фаза (Споредливост на FDA и очекувања за пренос на метод).
Заклучок
Одлуката се сведува на едно прашање поставено по правилен редослед: што бара наменетата цел, и дали методот на платформа го исполнува тоа? Прво напишете го аналитичкиот целен профил, преку ICH Q14, потоа тестирајте го методот против EMA 0.1% праг на известување, ICH Q2(R2) правци за демонстрирање на специфичноста, и докази за присилна деградација за способност што укажува на стабилност. Ако методот ги расчисти тие порти, користете го како што е и запишете ги ограничувањата. Ако не успее во опсегот на параметрите, оптимизирајте по редоследот што е важен: мобилна фаза, колона хемија, температура, потоа наклон на градиент. Ако не успее на селективност, додадете ортогонален режим што не ја дели истата слепа точка. Ако ATP не може да се исполни без повторно да се изгради методот околу аналитот, се посветат на развој специфичен за соединенија, што е она што го поддржуваат доказите на ниво на класа.
Пакетот за трансфер е местото каде што одлуката ја тестира некој друг. Изведете го мерењето на волуменот на просторот, многу колона и историја на условување, записот за подготовка на мобилната фаза и необработените електронски податоци, бидејќи условот за реконструкција на MHRA е она што ќе го примени рецензентот. Следниот чекор е да го земете АТП за низата пред вас и да ја извршите според критериумите за шест порти; ако сакате втор пар очи на таа проценка, разговарајте со експерт пред методот да влезе во поднесување.
