Een geschikte oplossingsmethode is een belangrijke factor voor het succes van peptide-experimenten. Onjuiste oplossing zal het verlies van peptiden en het mislukken van het experiment veroorzaken. Echter, het vinden van de ideale oplossingsmethode is soms een hele uitdaging. Hieronder volgen de ontbindingsmethoden die worden voorgesteld door de twee technische groepen van MOL Changes. methode
MOL Changes Technology Group Ontbindingsgids
Het belangrijkste probleem bij het oplossen van peptiden is de vorming van een secundaire structuur.
Hoewel de vorming van secundaire structuren van hydrofobe peptideketens duidelijker is, behalve de kortste peptideketens, dit fenomeen komt voor in vrijwel alle peptideketens, ongeacht de polariteit. Daarom, het eerste principe van het oplossen van polypeptiden is het gebruik van steriel gedestilleerd water of gedeïoniseerd water (of zuurstofvrij water als de omstandigheden dit toelaten).
De peptideoplossing kan bacteriële afbraak tegenkomen. Om dit fenomeen te voorkomen, het peptide moet worden opgelost in steriel gedestilleerd water, of gefilterd met een filtermembraan met een poriegrootte van 0.45 of 0.2 μm voor sterilisatie. Polypeptiden die Cys bevatten, Ontmoet, en Trp zijn bijzonder gevoelig voor oxidatie, ze moeten dus worden opgelost in zuurstofvrij water. Zuurstofvrij water kan worden verkregen door te ontgassen onder verminderde druk door het injecteren van inerte gassen (stikstof, helium, en argon).
Als het peptide onoplosbaar is in zuiver water, ultrasone behandeling kan helpen de deeltjes af te breken en de oplosbaarheid te vergroten. Opmerking: Ultrasone behandeling zal verwarming van de oplossing en afbraak van het peptide veroorzaken.
Als het peptide meerdere basische aminozuren bevat, gebruik een waterige azijnzuuroplossing van 1 ~ 10%; voor zeer hydrofobe peptiden, gebruik 50% azijnzuur.
Als het polypeptide een grote hoeveelheid zure aminozuren bevat, het kan worden opgelost in a 1 naar 10% ammoniakoplossing of een vluchtige alkalische buffer zoals ethylmorfineacetaat of bicarbonaat. Vóór de chromatografie moet de pH-waarde worden aangepast.
Als het peptide op de kolom moet worden geladen, de hoeveelheid organisch oplosmiddel moet zeer klein zijn, anders wordt de bewaartijd ernstig beïnvloed.
Als het polypeptide zeer hydrofoob is omdat het aromatische koolwaterstofzijketens bevat, zoals Val, Leu, Ontmoet, Ph, Tyr, Helaas, enz., of is een neutraal peptide, het gebruik van membraandenaturanten zoals DMF of DMSO kan helpen het polypeptide op te lossen:
A. Membraandenaturanten met een hoge concentratie helpen het polypeptide op te lossen door de secundaire structuur ervan te vernietigen.
B. Membraandenaturanten zijn geschikt voor de bereiding van peptide-analyseoplossingen, maar kunnen het onderzoek naar hun biologische activiteit verstoren.
C. DMF is het beste denatureringsmiddel (de hoogste concentratie kan bereiken 30%), en wordt druppelsgewijs toegevoegd totdat het peptide is opgelost.
D. Tijdens omgekeerde fasechromatografie, DMF zal samen met de voorpiek van het eluens naar buiten stromen. Afhankelijk van het injectievolume, de piekwaarde kan erg hoog zijn. De meeste peptiden kunnen binnen enkele minuten elueren nadat een grote hoeveelheid DMF is geëlueerd. Als de peptideketen klein is en te vroeg elueert, de hoeveelheid van het peptide zal worden verminderd.
MOL Wijzigingen Technische Groep II Ontbindingsgids
Hoe onderscheid je of aminozuren neutraal zijn?, zuur of alkalisch, en bereken de oplossingsmethode:
1. Wijs elk zuur aminozuur in de polypeptidesequentie toe, inclusief asparaginezuur Asp (D), glutaminezuur Glu (E) en C-terminale carboxyl-COOH als -1; elk basisch aminozuur inclusief arginine Arg ( R), lysine Lys (K), histidine His (H) en aan het N-terminale amino-NH2 wordt een waarde toegekend van +1; neutrale aminozuren zijn 0. Op basis hiervan, de waarde van het gehele polypeptide wordt berekend, en de score is positief. Peptiden met een negatieve score worden basische peptiden genoemd, degenen met een negatieve score worden zure peptiden genoemd, en degenen met een score van nul worden neutrale peptiden genoemd.
2. Als het een alkalisch peptide is, probeer het eerst op te lossen met water; als het niet kan worden opgelost, proberen te gebruiken 10% – 30% azijnzuur; als het peptide nog steeds onoplosbaar is, probeer puur azijnzuur en trifluorazijnzuur TFA te gebruiken (<50 μl) om het op te lossen, en verdun vervolgens de peptide-oplossing tot de gewenste concentratie.
3. Als het een zuur peptide is, probeer het eerst op te lossen met water; als het niet met water kan worden opgelost, proberen te gebruiken 13% ammoniakwater (v/v) om het op te lossen, en verdun de peptide-oplossing tot de vereiste concentratie. Als de peptidesequentie cysteïne Cys bevat (C), het kan niet worden opgelost in een alkalische oplossing. Probeer de onderstaande methoden.
4. Neutrale peptiden worden gewoonlijk opgelost in organische oplosmiddelen. Eerst, probeer acetonitril te gebruiken (acetonitril), of methanol (methanol) of isopropanol (isopropanol) oplossen; voor zeer hydrofobe peptiden, eerst oplossen met een kleine hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO) en verdun met water tot de vereiste concentratie; als de peptidesequentie cysteïne Cys bevat (C), gebruik dimethylformamide (DMF) of N-methylpyrrolidon (NMP) voor ontbinding. Voor peptiden die gevoelig zijn voor aggregatie, voeg eerst 6M guanidine·HCl of 8M ureum toe (Ureum) om ze op te lossen, en verdun ze vervolgens tot de vereiste concentratie.
illustreren:
1. Om de opslag en het daaropvolgende gebruik te vergemakkelijken, het wordt aanbevolen om het peptide op te lossen tot een concentratie van ongeveer 1-2 mg/ml.
2. Gewoon peptidegevriesdroogd poeder kan langer dan een jaar bij -20°C worden bewaard. Voor opgeloste peptiden, Het wordt aanbevolen om een hoeveelheid te verdelen en bij -20°C te bewaren; als de peptidesequentie methionine Met bevat (M), cysteïnezuur Cys (C) of tyrosine Tyr (Y) Het wordt aanbevolen om te worden opgeslagen in een zuurstofvrije omgeving om oxidatie te voorkomen.
Bijgevoegde aminozuurlijst:
1.Neutrale aminozuren: glycine, Alanine, leucine, isoleucine, valine, cysteïne, methionine, threonine, serine, fenylalanine, tyrosine, tryptofaan zuur, proline, asparagine en glutamine
Feet: Dit type aminozuurmolecuul bevat slechts één aminogroep en één carboxylgroep
2.Zure aminozuren: glutaminezuur, asparaginezuur
Functies: Dit type aminozuurmolecuul bevat één aminogroep en twee carboxylgroepen
3.Basische aminozuren: lysine, arginine, histidine
Functies: Dit type aminozuur bevat een diaminocarboxylgroep in zijn molecuul; histidine heeft een stikstofring en is zwak alkalisch, en is ook een basisch aminozuur.
