Lämplig upplösningsmetod är en viktig faktor för framgången med peptidexperiment. Felaktig upplösning kommer att orsaka förlust av peptider och misslyckas med experimentet. Dock, att hitta den ideala upplösningsmetoden är ibland ganska utmanande. Följande är upplösningsmetoderna som föreslagits av de två tekniska grupperna av MOL Changes. metod
MOL Changes Technology Group Upplösningsguide
Huvudproblemet vid peptidupplösning är bildandet av sekundär struktur.
Även om bildandet av sekundära strukturer av hydrofoba peptidkedjor är mer uppenbart, förutom de kortaste peptidkedjorna, detta fenomen förekommer i nästan alla peptidkedjor, oavsett polaritet. Därför, den första principen för att lösa upp polypeptider är att använda sterilt destillerat vatten eller avjoniserat vatten (eller syrefritt vatten om förhållandena tillåter).
Peptidlösningen kan stöta på bakteriell nedbrytning. För att undvika detta fenomen, peptiden ska lösas i sterilt destillerat vatten, eller filtreras med ett filtermembran med en porstorlek på 0.45 eller 0.2 μm för sterilisering. Polypeptider innehållande Cys, Träffade, och Trp är särskilt känsliga för oxidation, så de bör lösas i syrefritt vatten. Syrefritt vatten kan erhållas genom avgasning under reducerat tryck genom insprutning av inerta gaser (kväve, helium, och argon).
Om peptiden är olöslig i rent vatten, ultraljudsbehandling kan hjälpa till att bryta upp partiklarna och öka lösligheten. Notera: Ultraljudsbehandling kommer att orsaka uppvärmning av lösningen och nedbrytning av peptiden.
Om peptiden innehåller flera basiska aminosyror, använd 1~10% vattenlösning av ättiksyra; för mycket hydrofoba peptider, använda 50% ättiksyra.
Om polypeptiden innehåller en stor mängd sura aminosyror, det kan lösas i en 1 till 10% ammoniaklösning eller en flyktig alkalisk buffert såsom etylmorfinacetat eller bikarbonat. pH-värdet måste justeras före kromatografi.
Om peptiden ska laddas på kolonnen, mängden organiskt lösningsmedel måste vara mycket liten, annars kommer retentionstiden att påverkas allvarligt.
Om polypeptiden är mycket hydrofob eftersom den innehåller aromatiska kolvätesidokedjor såsom Val, Leu, Träffade, Phe, Tyr, Ala, etc., eller är en neutral peptid, användningen av membrandenatureringsmedel såsom DMF eller DMSO kan hjälpa till att lösa upp polypeptiden:
a. Högkoncentrerade membrandenatureringsmedel hjälper till att lösa upp polypeptiden genom att förstöra dess sekundära struktur.
b. Membrandenatureringsmedel är lämpliga för framställning av peptidanalyslösningar, men kan störa forskningen om deras biologiska aktivitet.
c. DMF är det bästa denatureringsmedlet (den högsta koncentrationen kan nå 30%), och tillsätts droppvis tills peptiden är upplöst.
d. Under omvänd faskromatografi, DMF kommer att flyta ut tillsammans med den främre toppen av eluenten. Beroende på injektionsvolymen, toppvärdet kan vara mycket högt. De flesta peptider kan eluera inom några minuter efter att en stor mängd DMF eluerat. Om peptidkedjan är liten och eluerar för tidigt, mängden peptid kommer att minska.
MOL Changes Technical Group II Upplösningsguide
Hur man särskiljer om aminosyror är neutrala, sura eller alkaliska, och beräkna upplösningsmetoden:
1. Tilldela varje sur aminosyra i polypeptidsekvensen inklusive asparaginsyra Asp (D), glutaminsyra Glu (E) och C-terminal karboxyl-COOH as -1; varje basisk aminosyra inklusive arginin Arg ( R), lysin Lys (K), histidin His (H) och den N-terminala amino-NH2 tilldelas ett värde av +1; neutrala aminosyror är 0. Baserat på detta, värdet av hela polypeptiden beräknas, och poängen är positiv. Peptider med negativ poäng kallas grundläggande peptider, de med negativ poäng kallas sura peptider, och de med poängen noll kallas neutrala peptider.
2. Om det är en alkalisk peptid, försök att lösa det med vatten först; om det inte går att lösa upp, försök använda 10% – 30% ättiksyra; om peptiden fortfarande är olöslig, försök att använda ren ättiksyra och trifluorättiksyra TFA (<50 μl) att lösa upp det, och späd sedan peptidlösningen till önskad koncentration.
3. Om det är en sur peptid, försök att lösa det med vatten först; om det inte kan lösas med vatten, försök använda 13% ammoniakvatten (v/v) att lösa upp det, och späd peptidlösningen till den erforderliga koncentrationen. Om peptidsekvensen innehåller cystein Cys (C), det kan inte lösas i alkalisk lösning. Prova metoderna nedan.
4. Neutrala peptider löses vanligtvis i organiska lösningsmedel. Första, försök använda acetonitril (acetonitril), eller metanol (metanol) eller isopropanol (isopropanol) att lösas upp; för mycket hydrofoba peptider, lös först med en liten mängd dimetylsulfoxid (DMSO) och späd med vatten till önskad koncentration; om peptidsekvensen innehåller cystein Cys (C), använd dimetylformamid (DMF) eller N-metylpyrrolidon (NMP) för upplösning. För peptider som är benägna att aggregeras, tillsätt först 6M guanidin·HCl eller 8M urea (Urea) att lösa upp dem, och späd dem sedan till önskad koncentration.
illustrera:
1. För att underlätta förvaring och efterföljande användning, det rekommenderas att lösa upp peptiden till en koncentration av ca 1-2 mg/ml.
2. Vanligt frystorkat peptidpulver kan förvaras vid -20°C i mer än ett år. För upplösta peptider, det rekommenderas att alikvotera och förvara vid -20°C; om peptidsekvensen innehåller metionin Met (M), cystein Acid Cys (C) eller tyrosin Tyr (Y) rekommenderas att förvaras i en syrefri miljö för att förhindra oxidation.
Bifogad aminosyralista:
1.Neutrala aminosyror: glycin, alanin, leucin, isoleucin, valin, cystein, metionin, treonin, serin, fenylalanin, tyrosin, tryptofansyra, prolin, asparagin och glutamin
Features: Denna typ av aminosyramolekyl innehåller endast en aminogrupp och en karboxylgrupp
2.Sura aminosyror: glutaminsyra, asparaginsyra
Drag: Denna typ av aminosyramolekyl innehåller en aminogrupp och två karboxylgrupper
3.Grundläggande aminosyror: lysin, arginin, histidin
Drag: Denna typ av aminosyra innehåller en diaminokarboxylgrupp i sin molekyl; histidin har en kvävering och är svagt alkaliskt, och är också en basisk aminosyra.
