Fare un passo 1: Definire l'unità di replica prima di leggere qualsiasi numero
Fornitore di peptidi personalizzati Proteine Spp La prima domanda non è “cos’è l’RSD” ma “cosa è stato replicato”. ICH Q2(R2) definisce la precisione a tre livelli, e ogni livello ha la propria unità di replica: la ripetibilità è la precisione nelle stesse condizioni operative in un breve intervallo, la precisione intermedia è la variazione all'interno del laboratorio rispetto ai cambiamenti tipici, e la riproducibilità è la precisione tra laboratori stabilita da una sperimentazione interlaboratorio (Io Q2(R2), adottato 1 novembre 2023). Un fornitore che invia un RSD senza nominare il livello ti ha inviato un numero che non puoi inserire.
Conta ciò che ti è stato dato rispetto ai minimi pubblicati. La ripetibilità dovrebbe essere valutata utilizzando un minimo di 9 determinazioni che coprono l’intervallo segnalabile, ad esempio 3 concentrazioni con 3 si replica ciascuno, o un minimo di 6 determinazioni a 100% della concentrazione di prova (Io Q2(R2), §3.3.2.1). Per precisione intermedia, i fattori che variano sono i giorni diversi, condizioni ambientali, analisti e attrezzature, come rilevante, e la linea guida incoraggia esplicitamente la progettazione di esperimenti piuttosto che studiare ciascun fattore isolatamente (Io Q2(R2), §3.3.2.2).
La riproducibilità è il livello più spesso affermato e meno spesso eseguito. Io Q2(R2) afferma che la riproducibilità viene valutata mediante uno studio interlaboratorio e che l'indagine sulla riproducibilità di solito non è richiesta per la presentazione normativa, ma dovrebbe essere preso in considerazione laddove una procedura è standardizzata, inserito in una farmacopea, o condotti in più siti (Io Q2(R2), §3.3.2.3). La distinzione non è accademica. In uno studio sull’ossitocina condotto in più paesi, %RSD da laboratorio a laboratorio raggiunto 2.3% mediante analisi HPLC, 4.73% mediante qNMR e 5.44% mediante analisi degli amminoacidi, mentre la percentuale RSD da campione a campione all'interno di un laboratorio lo era 0.7%, 1.85% E 1.78% rispettivamente (Li et al., J Pharm Biomed Anal 166, 2019). Il divario tra queste due serie di cifre è la dimensione dell’incertezza che nasconde un numero di purezza di un singolo laboratorio.
Il motivo per cui non è possibile citare alcuna soglia dalle linee guida è intenzionale. Io Q2(R2) non imposta alcun limite di precisione numerica universale; i criteri di accettazione devono essere predefiniti e giustificati dallo scopo della procedura, intervallo segnalabile, prodotto, variabilità analitica e specifica normativa (Io Q2(R2)). Una cifra di precisione senza la sua unità replicata non è una dichiarazione di incertezza, e un criterio senza una base dichiarata non è un criterio di accettazione.
Fare un passo 2: Chiedere cosa fa il metodo al campione prima che raggiunga il rilevatore
Alcune delle impurità segnalate da un metodo possono essere create dal metodo stesso. UN 2024 Il documento sul metodo di chimica analitica afferma chiaramente la premessa: l'aumento della temperatura della colonna migliora la separazione cromatografica dei peptidi, ma le alte temperature inducono modifiche artificiali che compromettono la qualità dell'analisi del peptide, e le modifiche nelle colonne possono elevare erroneamente i livelli di alcuni attributi di qualità critici (Starovoit et al., Anale. Chimica. 96(36), 2024). Questo è il quadro per l'analisi dei peptidi di degradazione in colonna: la domanda non è se la colonna è calda, ma se il metodo controlla ciò che fa il calore.
Il documento illustra inoltre l'aspetto di un controllo. Una breve colonna trappola in linea mantenuta a temperatura prossima a quella ambiente a monte della colonna di separazione riscaldata ha aumentato la capacità di picco di 1,4 volte in una mappatura del peptide trastuzumab di 110 minuti, consegnato 10% più identificazioni di peptidi, e ridotti artefatti legati alla temperatura 66% per pyroGlu N-terminale e 63% per Met ossidato rispetto all'iniezione diretta a 60 °C (Starovoit et al., Anale. Chimica. 96(36), 2024). La riduzione è il risultato finale: una modifica documentata che rimuove una frazione definita della modifica creata dalla misurazione.
Il meccanismo dietro l'artefatto è un effetto del tempo di residenza, e la stessa fisica governa la ritenzione. Nella LC del peptide in fase inversa, la regione idrofobica del peptide si adsorbe alla fase legata finché la forza del solvente non raggiunge il punto in cui si desorbe, e le impurità di ioni metallici nel sistema causano scodamenti dei picchi e perdita di risoluzione (Carr, Guida ACE all'HPLC in fase inversa di proteine e peptidi, guida tecnica senza data). Non è stato dimostrato che un livello di impurità riportato senza un controllo di degradazione sia una proprietà del campione piuttosto che una proprietà dello strumento. Notare il limite delle prove: il documento riporta riduzioni degli artefatti, non un tasso di degradazione in colonna di base, quindi non è possibile citarne alcuna percentuale di perdita per iniezione.
Fare un passo 3: Progetta l'esperimento di degrado che stai richiedendo
Questo è il passaggio in cui smetti di valutare e inizi a specificare. In letteratura esiste un progetto replicabile realizzabile: ciascuna libreria è stata testata tre volte, ciascuno in triplice copia con tre ripetizioni tecniche per 27 pozzi per condizione, campionamento ad ore 0, 1, 4, 8, 24 E 48 in duplice copia, con un'aliquota misurata immediatamente e l'altra congelata a -80 °C, e uno standard interno la cui area di picco è rimasta al di sopra 92% del 0 h picco a 48 H (Rozans, Moghaddam, Pashuck, J Biomed Mater Res A, prestampa 2024, versione sottoposta a revisione paritaria 2025). Questa struttura è ciò che rende tracciabile una richiesta di degrado, perché ogni valore riportato corrisponde a un pozzo, un punto temporale e un'aliquota.
Utilizzare l'esperimento di degradazione citato come esempio, non è un modello obbligatorio. Seleziona preparazioni indipendenti, ripetizioni tecniche, punti temporali e criteri standard interni basati sulla cinetica prevista, precisione e recupero. Distinguere un osservato >92% segnale da una soglia di accettazione prospetticamente giustificata.
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Campo |
Esempio pubblicato, non è un criterio di accettazione |
Modalità di guasto se assente |
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Replicare la struttura |
3 corre × 3 replica × 3 ripetizioni tecniche |
Nessuna base per la RSD dichiarata |
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Punti temporali |
0, 1, 4, 8, 24, 48 H, Fabbrica di polipeptidi sintetici aliquote duplicate |
Non è possibile inserire il tasso di degradazione Produttore del peptide S |
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Gestione delle aliquote |
Uno misurato immediatamente, uno congelato a -80 ° C |
Perdita di storage indistinguibile dal degrado |
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Criterio standard interno |
Zona di punta >92% Di 0 h a 48 H |
La perdita di analita non può essere separata dalla perdita di segnale |
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Campioni bianchi e stressati |
Incluso in ogni momento |
Picchi creati dal metodo riportati come impurità del campione |
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Controllo della colonna fresca |
Stesso lotto, nuova colonna |
Cronologia della colonna confusa con il campione |
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Lotto di colonne alternative |
Secondo lotto, Sintesi di peptidi pinzati stesso metodo |
Effetto lotto invisibile |
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Conferma ortogonale |
Seconda tecnica su un sottoinsieme |
Artefatto a metodo singolo incontrastato |
Lo studio sull’ossitocina mostra perché i criteri di esclusione sono importanti tanto quanto i criteri di inclusione. I risultati dell’analisi degli aminoacidi di un laboratorio sono stati invalidati per una risposta standard degli aminoacidi incoerente, i risultati HPLC di un laboratorio sono stati esclusi perché non è stato possibile ottenere un contenuto di acqua Karl Fischer stabile, e un valore HPLC è stato escluso come valore anomalo, quindi il numero dei laboratori utilizzabili è sceso al di sotto del numero iniziato (Li et al., J Pharm Biomed Anal 166, 2019). Chiedere le esclusioni e il motivo di ciascuna.
La parte anagrafica della stessa richiesta è regolata da ALCOA+ e Part 11. Le linee guida dell’MHRA trattano l’integrità dei dati come un risultato del ciclo di vita piuttosto che come una lista di controllo: non c'è differenza nelle aspettative indipendentemente dall'acronimo utilizzato, perché le misure di governance dei dati dovrebbero garantire che i dati siano completi, coerente, duraturi e disponibili per tutto il ciclo di vita dei dati, e la traccia di controllo è la creazione della registrazione dei metadati, modifica o cancellazione dei record GxP (Linee guida e definizioni sull'integrità dei dati MHRA GxP, Revisione 1, Marzo 2018). Parte 11 richiede sicurezza, generato dal computer, tracce di controllo con timestamp che non oscurano le informazioni registrate in precedenza, conservati almeno finché il soggetto registra e sono disponibili per la revisione dell'agenzia, inoltre protezione dei record per un pronto recupero e controlli di autorità (21 CFR parte 11, testo eCFR attuale). Per la due diligence del pacchetto dati CRO, richiedere la tabella per iniezione con lotto, ID del metodo, tracciabilità di colonne e gradienti, non il riassunto. Librerie di peptidi sintetici
Fare un passo 4: Predefinire l'idoneità del sistema invece di accettarla a posteriori
Predefinire test di idoneità del sistema e criteri di accettazione utilizzando la monografia attualmente applicabile, Metodo ed edizione compendiale. La citata USP 31/NF 26 il testo è storico; il suo esempio di iniezione replicata non dovrebbe essere presentato come una regola attuale universale per l'HPLC peptidico.
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Il capitolo stabilisce anche quando contano i risultati. Nessuna analisi del campione è accettabile a meno che non siano stati soddisfatti i requisiti di idoneità del sistema, e le analisi dei campioni ottenute mentre il sistema non soddisfa tali requisiti sono inaccettabili (USP <621>). Il concetto alla base dei test è che l'attrezzatura, elettronica, le operazioni analitiche ed i campioni costituiscono un sistema integrale valutato come tale (USP <621>). Questo è il motivo per cui una mancata idoneità non è una nota a piè di pagina di un pacchetto di dati; invalida le iniezioni effettuate durante esso.
Altri due punti vi proteggono da criteri che sembrano autorevoli ma non lo sono. Primo, <621> non impone alcun limite numerico universale: ne definisce i parametri, compresa la risoluzione o il rapporto picco-valle, ripetibilità, simmetria o fattore di scodamento, piastre teoriche, fattore di ritenzione e rapporto segnale-rumore ove rilevante, ed i limiti numerici provengono dalla monografia individuale o dalla procedura validata (USP <621>). Risoluzione ≥1,5, tailing ≤1,5 e RSD ≤2,0% circolano nel materiale del fornitore come se fossero requisiti universali; non lo sono, e non è stata trovata alcuna fonte farmacopea primaria per i limiti numerici specifici del peptide. Secondo, dove conta più di un picco, l'efficienza della colonna è un mezzo meno affidabile per garantire la risoluzione rispetto alla misurazione diretta (USP <621>), quindi il conteggio delle lastre è una prova più debole della risoluzione misurata. Chiedere al fornitore di indicare i criteri di idoneità del sistema per l'HPLC con peptidi nel metodo, con la fonte di ciascun limite.
Fare un passo 5: Degradazione separata nella fiala, Campionatore automatico, Fase mobile e iniettore dalla degradazione nella colonna
Una perdita di peptide intatto non è automaticamente una proprietà del campione. I driver nella colonna sono la temperatura e il tempo di permanenza, ed entrambi sono controllabili attraverso la progettazione del metodo (Starovoit et al., Anale. Chimica. 96(36), 2024). Fuori dalla colonna, il comportamento di ritenzione e la contaminazione da ioni metallici producono scodamenti e perdite di risoluzione che possono essere scambiati per degradazione (Carr, Guida ACE). Ciascun sito candidato necessita del proprio controllo discriminante prima di attribuire un risultato alla molecola.
La robustezza è il luogo a cui appartengono questi controlli, ed è un'attività di sviluppo. ICH Q14 definisce la robustezza come una misura della capacità della procedura di soddisfare i criteri di prestazione attesi durante il normale utilizzo, testato mediante variazioni deliberate dei parametri della procedura analitica, e dovrebbe considerare la durata dell'analisi inclusa la stabilità delle preparazioni dei campioni e dei reagenti (Io Q14, adottato 1 novembre 2023). La stessa linea guida afferma che per la maggior parte delle procedure la valutazione della robustezza viene condotta durante lo sviluppo e, se già fatto lì, non è necessario ripeterlo durante la convalida (Io Q14, §5.1). Un fornitore che non è in grado di produrre dati sulla robustezza dello sviluppo non ha svolto il lavoro o lo sta trattenendo; entrambe le risposte ti sono utili.
La variazione da sistema a sistema è misurabile, e il benchmark pubblicato è vecchio. Una nota applicativa del fornitore sulla mappatura dei peptidi su tre sistemi UPLC identici, uno al giorno con sei iniezioni consecutive ciascuna, riportato una riproducibilità del tempo di ritenzione all'interno di un sistema migliore di 0.3% RSD, deviazione standard tra sistemi migliore di 0.20 minuti per i picchi dei marcatori, e %RSD dell'area del picco migliore di 3.3% all'interno di un sistema e in mezzo 5.0% E 6.3% in tutte le corse (Nota applicativa sulle acque 720003175, Luglio 2009). Consideralo come un punto di riferimento datato su un metodo di mappatura dei peptidi, e notare che il venditore vende i sistemi testati. Il limite dell’ambito conta più dei numeri: un unico laboratorio, il pacchetto a colonna singola non può stabilire la riproducibilità da laboratorio a laboratorio, qualunque sia il suo RSD interno.
Fare un passo 6: Richiedere che l'incertezza venga segnalata con il relativo intervallo e i relativi criteri di accettazione
Un RSD semplice è un rapporto incompleto, e lo dice la linea guida. La precisione deve essere riportata come deviazione standard, la relativa deviazione standard, e un appropriato 100(1-UN)% intervallo di confidenza o intervallo statistico alternativo giustificato, e l'intervallo osservato dovrebbe essere compatibile con i corrispondenti criteri di accettazione della precisione, salvo diversa giustificazione (Io Q2(R2), Fare un passo 5 revisione 2, §3.3.2.4). La stessa struttura si applica alla precisione: riportare il recupero percentuale medio o la differenza rispetto al valore vero accettato con un intervallo di confidenza compatibile con i criteri di accettazione dell'accuratezza (Io Q2(R2), §3.3.1.4).
Lo studio sull'ossitocina mostra cosa fa un intervallo che una stima puntuale non può fare. La media qNMR era 1.798 mg con a 95% intervallo di confidenza di 1.707 A 1.888 mg, e la media dell'analisi degli aminoacidi era 1.73 mg con a 95% intervallo di confidenza di 1.580 A 1.884 mg (Li et al., J Pharm Biomed Anal 166, 2019). I tre metodi convergevano su valori centrali comparabili, 1.807 mg mediante HPLC, 1.798 mg mediante qNMR e 1.73 mg da AAA, pur differendo sostanzialmente in termini di precisione, che è un esempio pratico di metodi ortogonali che concordano nel valore centrale e in disaccordo nell'incertezza.
Leggere l'intervallo rispetto a un criterio, e leggere il criterio rispetto alla sua base. Perché ICH Q2(R2) non imposta alcun limite di precisione numerica universale, il criterio di accettazione deve essere predefinito e motivato dallo scopo della procedura, intervallo segnalabile, prodotto, variabilità analitica e specifica normativa, e il protocollo di validazione dovrebbe indicare lo scopo previsto, le caratteristiche prestazionali, il disegno sperimentale ed i criteri (Io Q2(R2)). Un intervallo senza alcun criterio accanto non può essere giudicato, e un criterio senza base dichiarata non può essere difeso in un deposito. Dove si fermano le prove: nessuna fonte in questa base di prove fornisce un criterio di accettazione numerico specifico del peptide, quindi il criterio deve derivare dalle vostre specifiche e dal metodo del fornitore, non da una linea guida.
Fare un passo 7: Verifica che i record siano connessi e pronti per il controllo
La catena di record fa parte del pacchetto dati, e l'applicazione mostra cosa si rompe. UN 2025 lettera di avvertimento indirizzata a un laboratorio di analisi a contratto ha riscontrato che l'Unità Qualità non è riuscita a garantire l'istituzione di un accesso limitato e controlli adeguati sui sistemi computerizzati per prevenire potenziali alterazioni o cancellazioni dei dati di laboratorio, e non è riuscito a controllare un documento di preparazione del campione (Lettera di avvertimento della FDA 320-25-101, 20 agosto 2025, risultati sotto FD&Atto C 501(UN)(2)(B)). UN 2026 nella lettera di avvertimento sono stati trovati record cromatografici strappati e scartati e fogli di calcolo per la convalida del metodo delle impurità mentre il record ufficiale conteneva solo valori scritti a mano, e il personale che registra le osservazioni in diari personali non controllati (Lettera di avvertimento della FDA MARCS-CMS 720463, 3 Marzo 2026, citando 21 CFR 211.22 E 211.192). Questi sono casi nominati, non un tasso; non è stato verificato alcun tasso ufficiale pubblicato sui risultati dell'integrità dei dati nelle ispezioni CRO.
I controlli su cui vengono mappati questi risultati sono specifici. Parte 11 richiede la convalida dei sistemi per garantire l’accuratezza, affidabilità, prestazioni previste coerenti e la capacità di discernere record non validi o alterati, controlli dell'autorità in modo che solo le persone autorizzate possano modificare un record, e manifestazioni di firma del nome stampato, data e ora, e significato (21 CFR parte 11, §11.10(UN), §11.10(G), §11.50(UN)). MHRA aggiunge che il passaggio da sistemi computerizzati a sistemi cartacei o viceversa non elimina la necessità di controlli sull'integrità dei dati, che le piste di controllo identificate dalla valutazione del rischio dovrebbero essere attivate e gli utenti non dovrebbero essere in grado di modificarle o disattivarle, e quello in cui i dati venivano catturati in uno stato elettronico dinamico, le copie cartacee non possono essere considerate dati grezzi (Linee guida e definizioni sull'integrità dei dati MHRA GxP, Revisione 1, Marzo 2018). Un cromatogramma PDF è quindi un rapporto, non dati grezzi, quando l’acquisizione sottostante era elettronica.
Un anello della catena non è stabilito da queste fonti. Evidenza della qualificazione dello strumento dietro un cromatogramma, la qualificazione del sistema che supporta la traccia di controllo e il record di acquisizione, è menzionato nel piano di valutazione ma il testo del capitolo pertinente della farmacopea non è stato letto all'interno di questa base di evidenze, quindi considera la qualificazione dello strumento come una domanda da porre piuttosto che un criterio da citare. Richiedere lo stato di qualificazione dello specifico strumento che ha prodotto i dati, insieme all'estratto della traccia di controllo.
Domande frequenti
Un pacchetto per singolo laboratorio stabilisce la riproducibilità?
NO. La riproducibilità è una misurazione tra laboratori, e la linea guida indica quando è previsto il lavoro interlaboratorio: quando una procedura è standardizzata, adottato in una farmacopea, o eseguire in più di un sito (Io Q2(R2), §3.3.2.3). Un laboratorio può mostrare ripetibilità, e può mostrare una precisione intermedia se varia deliberatamente di giorni, analisti e attrezzature (Io Q2(R2), §3.3.2.2). Non può mostrare un accordo tra i laboratori, quindi un pacchetto etichettato come “riproducibilità” che non ha mai lasciato un sito è etichettato erroneamente.
Quante iniezioni replicate dovrei aspettarmi per un metodo di purezza HPLC peptidico?
Determinare le iniezioni replicate dal metodo attualmente applicabile e dai requisiti compendiali. Iniezioni di idoneità del sistema, le preparazioni indipendenti dei campioni e le determinazioni di validazione del metodo hanno scopi diversi e non devono essere conteggiate in modo intercambiabile.
Posso utilizzare una tecnica analitica diversa dall'HPLC?
Scegli la tecnica in base all'attributo e all'incertezza prevista. Il citato studio interlaboratorio sull'ossitocina riporta i risultati del suo materiale, laboratori e metodi; non classifica la precisione attesa dell'HPLC, Analisi qNMR e degli aminoacidi per ogni peptide.
Cosa devo fare se il CRO segnala un livello di impurità senza controllo del degrado?
Trattare il numero come non assegnato finché un controllo non separa il campione dal metodo. Soltanto le condizioni della colonna possono produrre il picco: A 60 °C, una colonna di trappola in linea quasi ambientale taglia gli artefatti piroGlu N-terminali di 66% e artefatti Met ossidati da 63% rispetto all'iniezione diretta (Starovoit et al., Anale. Chimica. 96(36), 2024). Questa è la domanda pratica dell'analisi dei peptidi di degradazione in colonna. Senza un controllo paragonabile, non è stato dimostrato che l'impurezza appartenga al lotto.
Una copia cartacea di un cromatogramma è accettabile come dati grezzi?
NO, dove i dati sono stati acquisiti elettronicamente. L'MHRA ritiene che le informazioni originariamente acquisite in uno stato dinamico dovrebbero rimanere disponibili in quello stato, e che una copia cartacea di dati dinamici generati elettronicamente non può essere considerata un dato grezzo (Linee guida e definizioni sull'integrità dei dati MHRA GxP, Revisione 1, Marzo 2018). Parte 11 richiede copie accurate e complete sia in formato leggibile dall'uomo che in formato elettronico idoneo all'ispezione (21 CFR parte 11, §11.10(B)). Richiedi il record elettronico con la relativa traccia di controllo, non una scansione.
Quanto costa aggiungere questo livello di prova??
In questa base di prove non esiste alcuna cifra di costo verificata, quindi la risposta onesta è che il costo è una decisione di progettazione piuttosto che un elemento pubblicitario. I conducenti sono numerabili: è stato utilizzato un progetto di degrado pubblicato 27 pozzetti per condizione in sei punti temporali con aliquote duplicate (Rozans, Moghaddam, Pashuck, J Biomed Mater Res A), e una convalida più completa del metodo analitico sui peptidi aggiunge un secondo lotto di colonna, un sottoinsieme di conferma ortogonale, e l'estratto della traccia di controllo. Chiedere al fornitore di valutare separatamente la struttura replicata e i controlli, così puoi vedere cosa compra ciascuno.
Conclusione
La valutazione si riduce a una regola decisionale che è possibile applicare in una revisione della partnership. Richiedere un nome all'unità replicata prima di leggere qualsiasi cifra di precisione, e contarlo rispetto all'ICH Q2(R2) minimi di 9 determinazioni nell’intervallo segnalabile o 6 A 100% della concentrazione di prova (Io Q2(R2), §3.3.2.1). Richiedi che la cifra di precisione arrivi con a 100(1-UN)% intervallo di confidenza e criterio di accettazione rispetto al quale è stato giudicato (Io Q2(R2), §3.3.2.4). Richiedere che i criteri di idoneità del sistema e il conteggio delle iniezioni siano indicati nel metodo, quindi la regola cinque contro sei nell'USP <621> può essere controllato (USP <621>). Richiedono un controllo del degrado che separi gli artefatti nella colonna e nel sistema dal degrado del campione, e richiedere la tabella per iniezione con lotto, metodo, tracciabilità delle colonne e del gradiente anziché del riepilogo. Richiedere la traccia di controllo e la registrazione elettronica, perché una copia cartacea non è un dato grezzo laddove l'acquisizione è avvenuta in formato elettronico (Linee guida e definizioni sull'integrità dei dati MHRA GxP, Revisione 1, Marzo 2018). Se un pacchetto fallisce uno di questi, il fallimento è una lacuna a cui puoi dare un nome nella recensione piuttosto che un dubbio su cui devi discutere. Il passaggio successivo consiste nell'inserire la tabella delle specifiche da Step 3 nella richiesta di proposta e chiedere un esempio di pacchetto dati che lo soddisfi.
